关于npr1基因植物表达载体构建及对玉米的遗传转化

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1、关于NPR1基因植物表达载体构建及对玉米的遗传转化导读：如何写好一篇植株和基因方面的论文。希望本篇NPR1基因植物表达载体构建及对玉米的遗传转化的论文范文会对你的写作构思有所启发以助大学生们轻松完成写作任务。马力，兰磊，郝明远，高杰，王培真，于蕴吉（长春市农业科学院，吉林长春130111）摘要：为了提高玉米的广谱抗病性，从拟南芥中克隆NPR1基，构建以bar基为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301NPR1，通过农杆菌介导法将pCAMBIA33植株和基因论文纲要格式01NPR1转入玉米自交系‘H99’

2、的愈伤组织中，用含10mg/mL草胺磷的筛选培养基进行筛选，共获得34株再生植株经过PCR和RTPCR鉴定，得到14株RTPCR阳性植株.结果表明，NPR1基玉米中得到表达.关键词：玉米NPR1基表达载体构建农杆菌介导转基植株玉米是一种重要的经济、粮食和饲料兼用作物[1]，但是其生长发育过程中容易受到真菌、细菌等病害，使其产量下降，造成严重的经济损失.此，何提高玉米的抗病性变得至关重要.病程相关基非表达子1（nonexpressorofphogenesisreledgenes1，NPR1）能够激发植物的防卫

3、反应，使植物产生抗病性，且具有广谱性[23].研究表明，拟南芥NPR1基突变后，提高了拟南芥对多种病菌的感病性，而过表达NPR1基提高拟南芥、麦、棉花、水稻等多种作物的广谱抗病性，但对作物生长无不良影响，这为利用基工程方法提高作物对病原菌的广谱抗性提供了新途径[49].此，为了提高玉米的广谱抗病性，本项研究利用RTPCR技术扩增拟南芥NPR1基，构建以bar基为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301NPR1，然后利用农杆菌介导法转化玉米愈伤组织，经过筛选获得转NPR1基的玉米植株，对转基植株进行PCR

4、、RTPCR检测，证实得到获得4株转基阳性植株，为通过转基技术手段选育广谱抗病玉米奠定了基础.1材料与方法1。1试验材料1）菌种与质粒：大肠杆菌E。coliDH5α，农杆菌菌株EHA105，植物表达载体pCAMBIA3301均由本实验室提供.2）试剂与酶：TaqDNA聚合酶、DNAMarker、T4DNA连接酶、pMD18Tvector、限制性内切酶（BstEⅡ、NcoI）、RNe均购自MBI公司，凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购、植物基组DNA提取试剂盒自北京天根生物试剂公司TotalRNAExtract

5、ionKit提取试剂盒、AMV反转录试剂盒均购自TaKaRa公司其他试剂为国产分析纯产品.3）引物：根据GenBank发表的拟南芥NPR1序列（U76707），利用Primerstar软件设计引物，划线部分为添加的限制性酶切位点，由TaKaRa公司合成.S：5acute;ATGGACACCACCATTGATGG3acute;（NcoI）AS：5’TTGGGTTACCTCACCGACGACGATGAGAGA3’（BstEⅡ）1。2试验方1。2。2植物表达载体pCAMBIA3301NPR1的构建及鉴定用NcoI

6、/BstEⅡ分别双酶切目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301，用试剂盒回收相应DN段，用T4连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后提取质粒DNA，经PCR、酶切鉴定正确后，获得植物表达载体pCAMBIA3301NPR1.该载体含有bar基，用于后期玉米遗传转化的筛选标记.1。2。3冻融法转化根癌农杆菌参见《分子克隆实验指南》第三版[10].1。2。4农杆菌介导的玉米遗传转化玉米愈伤组织的遗传转化参照姚丹等[11]的方法进行.将农杆菌侵染后的愈伤组织恢复培养7d，转移到含有10mg/

7、L草胺磷的筛选培养基上筛选4～6周，然后再将抗性愈伤组织转移到分化培养基上分化成苗，待苗生长到约4～5cm时移入生根培养基，生出2～3条主根和若干须根后炼苗3d，然后移入蛭石和土占1/2的花盆中，用塑料袋包裹保湿，7d左右打开塑料袋，然后移入温室.1。2。5转基植株的PCR检测取再生植株的叶片，用植物基组DNA提取试剂盒提取基组DNA.对34株转基苗进行PCR检测，未转基的植株作为阴性对照.1。2。6转基植株的RTPCR检测利用TotalRNAExtractionKit提取试剂盒提取转基阳性植株和未转化植株

8、的叶片总RNA，然后反转录，以反转录的cDNA为模板，通过RTPCR方法扩增NPR1基.2结果与分析2。1拟南芥NPR1基的克隆经RTPCR扩增得到1条长约1800bp的特异性条带，与预期结果一致（图1）.将PCR产物回收纯化后与T载体连接，得到重组克隆载体（pMDNPR1）测序结果此篇NPR1基因植物表达载体构建及对玉米的遗传转化原创shuoshilung/mL的筛选培养基对其进行筛选2～3轮后，再将抗性愈伤组