玉米α-淀粉酶基因花粉特异表达载体构建及愈伤组织的遗传转化

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1、万方数据四川农业大学硕士毕业论文SichuanAgriculturalUniversityMasterDissertationConstructionandgenetictransformation，、1●，’^●Otpollen=specltlCvectorOt0c—amVlaSegene1nmalZeBy：XieChengcheng一(Major：BiochemistryandMolecularBiology)DirectedbyProfessorCaomo-juMaizeResearchinstituteSichuanagriculturalunivers

2、ityMav2014万方数据四川农业大学硕士毕业论文论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：谋程程M牛年多月／2日，关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版

3、，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：谅翟程翩硌扔蒴≥口

4、十年{)窍f≥日矽，毕年钿，文日㈣呵脚7懿舢1㈣加万方数据四川农业大学硕士毕业论文摘要玉米是我国第一大粮食作物，作为工业原料、农业饲料、口粮和种子在国民经济的发展中占据举足轻重的地位。但我国人口众多，农村劳动力极度紧缺，随着饲料消费和玉米深加工消费的增长，愈发显现出我国人均玉米占有量低，刚性需求却越来越大的矛盾。不育系制种是世界范围内广泛采用的提高玉米杂交种产量的重要手段。人们

5、在研究雄性不育机理的过程中逐渐加深了对植物生殖发育分子机理的研究，使得利用基因工程创造雄性不育系为作物育种开辟了一条崭新的道路。美国先锋公司发明的玉米SPT(SeedProductionTechnology)制种技术实现了核不育系的保持，不育系与保持系一系两用，能够方便有效区分可育株与不育株，选种时利用种子颜色差异可满足全程机械操作，繁殖时只需隔离自交，杂交F1代皆为非转基因种子，它使大规模安全利用杂种优势成为可能。本课题组经空间诱变获得稳定核不育系Sicau．ms，为使其能更快的应用于核不育系育种，实现核不育系的保持，本研究借鉴SPT制种技术的成功经验，利用重

6、叠PCR和酶切连接相结合的方法构建出可以使花粉败育的淀粉酶基因花粉特异表达载体，通过农杆菌介导法将淀粉酶基因花粉特异表达载体转化优良自交系18．599R的愈伤组织。研究结果如下：1．利用高保真酶KODFx，以B73叶片总DNA为模板扩增花粉特异表达启动子Pg(X66692)，造粉体信号肽btl(NM001l12419)和苯磺胺代替物基因的终止子In2．1(NM00111963)，以18-599R萌发种子的cDNA为模板扩增01．淀粉酶基因(NM001156806)。通过目的片段回收测序，经NCBI进行序列比对，序列相似性分别为99％，100％，100％和95％。

7、2．利用降落重叠PCR(TD．SOE．PCR)方法将4个目的片段按启动子Pg、信号肽btl、cc．淀粉酶基因、终止子In2．1的次序进行连接。设计具有反向互补末端的引物，分别以含4个目的片段的质粒为模板，用高保真酶KODFx扩增出具有反向互补粘性末端的目的片段，且在启动子Pg的5’端和终止子In2．1的3’端分别引入酶切位点HindⅢ和EcoRI。采用降落重叠PCR(TD．SOE．PCR)的方法使具有互补链的各个片段通过重叠链的延伸拼接起来。将拼接后的淀粉酶基因表达盒连入零背景载体pEASY．B．Z后转化大肠杆菌，挑取单克隆进行菌液扩繁，提取质粒送往公司测序，经

8、NCBI序列比对证实连接产物连接顺序正确无误，且序列相似性达99％。万方数据四川农业大学硕士毕业论文3．将淀粉酶基因表达盒成功连入植物表达载体CPB。用内切酶HindIII$口EcoRI酶切连入了淀粉酶基因表达盒的零背景载体质粒，回收淀粉酶基因表达盒。并用HilldⅡI和EcoRI酶切表达载体CPB的质粒，获得线性化载体。利用T4DNA连接酶将二者进行连接。成功连接后将淀粉酶基因特异表达载体进行大肠杆菌的转化，涂于抗kana的平板上，12．16h后挑取单克隆进行扩繁，提取质粒，用EcoRI和HindHI37℃酶切过夜后进行琼脂糖凝胶电泳，并以原始的CPB质粒为阴

9、性对照，以淀粉酶基因表达