bi121lyzgfp基因表达载体的构建及其对紫花苜蓿愈伤组织的转化

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1、甘肃农业大学2008届硕上学位论文摘要以紫花苜蓿不同品种(“甘农3号”、和田苜蓿、秘鲁苜蓿)为研究对象，进行了抗病基因对紫花苜蓿的转化的研究。筛选出了愈伤组织诱导的最佳培养基及其激素组合；构建了GFP(greenfluorescentprotein，绿色荧光蛋白)和Lyz(1ysozyme，溶菌酶)基因的表达载体PBll21．Lyz—GFP；优化了农杆菌介导的苜蓿基因转化体系；并将抗病基因Lyz基因和报告基因GFP导入和田苜蓿中。对转化的愈伤组织进行了分子检测及荧光检测，证实了Ly'z基因和GFP已整合到苜蓿基因组

2、中并得到表达。主要研究成果如下：1、运用正交试验设计，建立苜蓿下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基。结果表明：对于秘鲁苜蓿和甘农3号苜蓿，最适愈伤组织诱导的培养基均为MS+2,4-D(2．0rag／L)+6-BA(0．5rag／L)+NAA(1．0mg／L)，各因素影响程度皆为6-BA>NAA>KT。对于和田苜蓿，最适愈伤组织诱导的培养基为MS+2,4·D(2．0rag／L)+6-BA(1．0rag／L)+KT(1．0mg／L)+NAAfl．0rag／L)，各因素影响程度为6．BA>KT>NAA。2、构建了GFP和Lyz

3、基因的植物表达载体PBll21一Lyz．GFP。将GFP基因插入到质粒载体PBll21．Lyz中，构建了含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体PBll21．Lyz．GFP，并通过液氨冻融法将其导入农杆菌LBA4404。3、遗传转化体系的建立。以培养7天的和田苜蓿的无菌苗下胚轴为外植体，以农杆菌菌株为介体，优化的基因转化体系如下：Kan筛选浓度定为40--50mg／L；抑菌剂选取Carb为宜，愈伤诱导阶段浓度为200mg／L；用于转化的侵染时间为10minl外植体预培养时间为3d；与农杆菌共培养3d。经筛选，得到69

4、块具有卡那霉素抗性的愈伤组织，经PCR扩增和荧光显微镜检测证明重组基因已成功转化至4和田苜蓿愈伤组织中。关键词：紫花苜蓿；愈伤组织诱导；溶菌酶：绿色荧光蛋白；载体构建；遗传转化Ⅱ甘肃农业大学2008届硕士学位论文SummaryTakenthedifferentvarietiesofalfalfa(Gan-uongNo．3．皿sativacVXinjiangDaye,Peru)astheobjectsofstudywhichcarryingonthedisease-resistantgeneforthetransfo

5、rmationresearchofalfalfa．Selectedthebestculturemediumandthecombinationofhormonetoinductthecallus；ConstructedtheexpressionvectorPBll21··Lyz--GFPwhichcontainedtheGFPandLyzgene；O#anizedthetransformationsystemofalfalfathroughtheAgrobacterinm-mediatedandinductedthe

6、disease-resistantgeneLyzandGFPintotheHefianalfalfa，thetransformationofcallushadbeendetectedbythemolecularidentificationandthefluorescentmicroscopeanalysis，TheresultcoafLrmedtheLyzandGFPgenehasbeenintegratedintothegeuomeofalfalfaandexpressedsuccessfully．Themain

7、researchreadts啪asfollows；1．Toinducethecallusofalfalfahypocotyls．thehighefficientmediumwasestablishedbyorthogonaldesign．Thedataw@reanalysedbyvisualanalysisandvarianceanalysis．Theresultsshowedthat：MS+2,4-D(2．0mg／L)+6-BA(0．5mg／L)+NA．A(1．0rag／L)isthebestmediumforP

8、eruandGan-nongNo．3toinducethecallus，theeffectsequenceofthreeauxinsis6-BA>NAA>KT．MS+2，4-D(2．0m∥Lp6-BA(1．Om班卜KT(1．0mg／L州AA(I．0mg／L)isthebestmediumforMsativaCV．XinjiangDayetoinducethe