基因枪转化小麦愈伤组织的影响因素研究

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1、基因枪转化小麦愈伤组织的影响因素研究第33卷第7期2005年7月西北农林科技大学(自然科学版)Jour.ofNorthwestSci—TechUniv.ofAgri.andFor.(Nat.Sci.Ed.)VOI.33NO.7July2005基因枪转化小麦愈伤组织的影响因素研究曹团武,朱建楚,亢福仁,陈耀锋曹鑫,赵云祥,任慧莉,李春莲(1西北农林科技大学农学院,陕西杨凌712100;2榆林学院,陕西榆林719000)[摘要]以小麦愈伤组织为受体材料,用基因枪法将报告基因GUS和目的基因Psag12一JP7

2、'导入小麦中GUS基因表达检测表明,金粉用量越高,转化频率越高;质粒DNA用量以2.0g/枪最佳;随着愈伤组织培养时间的延长,GUS基因瞬时表达呈明显下降趋势,至第28天以后趋于稳定.另外,GUS基因瞬时表达检测应在24h内进行.[关键词]转基因小麦;基因枪;愈伤组织;GS基因;瞬时表达[中图分类号]s512.1O3.53[文献标识码]A[文章编号]1671—9387(2005)07—0065—03小麦是世界上最主要的粮食作物之一,培育小麦优良品种是小麦稳产,高产的重要途径.自美国学者Vasil等[】利用

3、基因枪将GUS和Bar基因导入小麦品种"Pavon",获得世界上第一例转基因小麦植株以来,利用基因工程对小麦进行遗传改良的现代小麦转基因技术得到了迅速发展[1.基因枪转化的应用使单子叶植物尤其是禾谷类作物的基因转化研究有了突破性进展.在基因枪转化中,基因枪的轰击参数,如微弹速度,射程,金粉用量,轰击次数,真空度,质粒DNA用量及受体材料的类型,生理状态,接受和整合外源DNA的能力等x~/J,麦遗传转化效率均有重要影响.本文以GUS基因为报告基因,抑制叶片衰老基因Psag12一ipt为目的基因,用基因枪轰击

4、小麦幼胚愈伤组织,通过对GUS报告基因的检测,研究了影响基因枪转化频率的几个主要因素及基因枪轰击后愈伤组织继续培养过程中G5基因的表达状况,旨在进一步提高利用基因枪进行小麦遗传转化时的转化效率.1材料与方法1.1试验材料与培养基1.1.1供试品种供试品种为西北农林科技大学细胞工程实验室培育的普通小麦新品系9848.1.1.2转化载体转化载体质粒是曹孟良博士构建的PCMLA35—1,含有潮霉素(Hymgromicin)[收稿日期][基金项目][作者简介][通讯作者]抗性基因HYGCR7,卡那霉素(kanma

5、ycin)抗性基因KancR和报告基因G.其中G基因编码区有1个能在植物中特异表达的内含子,使GUS基因不能在细菌中表达.抑制叶片衰老基因Psag12一ipt构建在载体pcMA35—1中,pcMA35—1能在大肠杆菌DH5a中扩增.1.1.3培养基愈伤组织诱导培养基:MS+2,4一D2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L,pH5.8.高渗培养基:MS+2,4一D2.0mg/L+KT0.3mg/L+蔗糖30g/L+甘露醇0.4mol/L+琼脂5.5g/L,pH5.8.1.2试验方法1.2.1质粒D

6、NA提取按大肠杆菌质粒碱裂解抽提法制备质粒DNA[】引.1.2.2愈伤组织诱导取扬花后14～16d的小麦幼穗,检测幼胚大小约1.0mm的籽粒,体积分数7O%乙醇中漂洗30S,在体积分数0.1%HgCI中浸泡消毒10min后,无菌水洗5次,于无菌条件下剥取幼胚,接种于愈伤组织诱导培养基上,置26C下散光培养.1.2.3金粉微弹制备称取12mg金粉,用500L体积分数为7O%乙醇洗涤2次,无菌水洗涤1次,体积分数5O无菌甘油调节浓度至40g/L,于4C保存备用.取金粉悬液(40~g/gL)50L,依2004—

7、09—14国家转基因专项(JYO3一B一23一O2);陕西省科技攻关项目(2OO3KO3一G1—04)曹团武(1977～),男,陕西杨凌人,在读硕士,主要从事农业生物技术研究.陈耀锋(1956～),男,陕西岐山人,教授,博士生导师,主要从事作物遗传育种和农业生物技术研究.西北农林科技大学(自然科学版)第33卷次加入质粒DNA(1g/L)10L,CaCI2(2.5mol/L)50ffL,0.1tool/L亚精胺(0.1tool/L)20L,涡旋振荡5min,室温下放置20min,3000×g离心90s,弃上

8、清,加600L体积分数7O%乙醇洗涤2次,无水乙醇悬浮沉淀,3000×g离心90s,弃上清,再用无水乙醇悬浮并依次产生质量浓度分别为4O,3O,2O和10g/L的金粉微弹悬液,每种金粉悬液均取1OL至微弹载体,无菌条件下吹干.1.2.4基因枪转化将培养15～17.d的小麦幼胚愈伤组织转入高渗培养基处理4～6h后,用PDS1000/He型基因枪轰击转化.金粉微粒直径为1.0tLm,轰击时氦气压力为7.689MPa,轰击距离为9c