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1、基因枪转化灿稻的影响因素第37卷第1期1998年i月中山大学(自然科学版)ACTASCIENTIARUMNATURALIUMUN1VERS1TATTSSUNYATSEN1Vo1.37No1Jani998,o)g一c7//基因枪转化籼稻的影响因素究,明/-州1李02宝75)510275健ff,(中山大学生物工程研究中心,州/摘要将含有gusA基因的质粒pActI—D包裹在钨粉上轰击籼稻初生愈伤组织,通过检测gusA基因在籼稻细胞中的瞬间表达情况.对影响基因枪法转化效率的固索进行了研究,这些固索包括傲粒加速装置参散,微粒参数,生物参数及其它参数.实验表明
2、,在合适的转化条件下.籼稻品种青风占12,穗优占的最高转化效率分别为439,915蓝点/皿.关键词分类号i茎垦丝莲t圭璺笾塑塑-堕笪墼璧.(GUS),转化效率Q812籼稻和粳稻是水稻的2个主要亚种,其中籼稻占水稻栽培品种的80,为全世界20亿以上的人口提供了主食.自1991年基因抢法转化水稻获得成功以来,不少实验室对水稻的基因枪转化系统进行了改进一.但是,与粳稻品种相比,籼稻品种的转化较为困难,转化频率比较低,培养周期过长,绝大多数在生产上有应用价值的优良品种难"转化成功本文广卅I地区推广的优良籼稻品种为转化材料,对影响基因抢法转化效率(y)的主要因
3、素进行了分析,为建立高效的籼稻转化系统打下基础.1材料与方法l,1基因枪本研究采用的JQ一700型高速基因枪(中科院生物物理所研制)为火药爆发气体推进式,可供选用的参数:火药弹为绿弹,蓝弹和红弹,其动力负荷依次增高;火药套管长ljmm,25mm,35mm,其相应配套的加速管分别为52mm,42mm,32mm;滤网为4o目,80目及100目;空气压力()为0.10～0.0lMPa,连续可调;靶距为6cm或9cm.1.2植物材料供试籼稻(~yzasativaL.ssp.indlcaKato)品种为青风占l2和穗优占,去壳的种子消毒后,接种在MS愈伤组织培
4、养基上.在暗中诱导培养2～14d后,分离出盾片部位诱导生长的愈伤组织作为靶样品.1.3质粒质粒pActl—D(由吴瑞教授赠送)含有由水稻Act一1启动子调控的gusA基因.采用碱?美国Rocketeller基金资助项目收稿日期:1997—04—24许新萍.女.32岁.讲师r几rr珊
5、第1期许新萍等:基因枪转化籼稻的影响因索89裂解法提取质粒DNA,并用PEG法加以纯化.1.4包裹质粒DNA的微粒的制备按照Sanford等【.:方法对钨粉进行处理.微粒的包裹方法作了改进:取2jL钨粉悬浮液(60p.g/~tL)用超声波清洁机超声处理3s,然后在不断旋涡
6、混匀情况下依次加入1～7.5L1~g/uL质粒DNA252.5mol/LCaC12及1O0,1mol/L亚精氨,将该混台液超声处理3s,置于冰上10min,脉冲离心(1000r/rain),吸去50L上清披,其余溶液混匀后即可上样,每次用量为1～7.5,注到塑料弹端部凹坑内.1.5基因枪转化将愈伤组织置于含MS愈伤组织培养基的培养皿中央约1.5em直径范围内,按照该基因枪说明书所述程序对靶样品进行轰击,每皿样品轰击1或2次,每种参数重复试验4皿样品.在部分实验中,转化时将愈伤组织放在含0.5mol/L渗压剂(等量的甘露醇和山梨醇)的MS愈伤组织培养基
7、上培养6h.1.6GUS检测经基因枪转化处理的愈伤组织暗培养48h后,按照Jefferson等【:方法进行组织化学染色.在Olympus解剖镜下观察和统计gusA基因瞬间表达产物与底物X-GLue反应产生的蓝点,每个蓝点作为1个"表达单位",y由每皿的蓝点数目代表24].2结果与讨论2.1微粒加速装置参数对y的影响2.1.1火药弹动力负荷,火药套管/iv速管长度使用蓝弹或绿弹,15mm火药套管,52mm加速管时,y较高.而用红弹,15mm火药套管,52mm加速管时,y几乎为零(表1).火药弹动力负荷越高,火药弹至塑料弹的距离(gg火药套管长度)越短,
8、塑料弹加速飞行距离(即加速管长度)越长,塑料弹能够达到的撞击挡板的速度就越高,因而微粒获得的初速度也越高,越能有效地穿透细胞壁,细胞膜,将外源基因导入细胞内.但同时,靶样品受到的冲击波也越强一,越易引起严重的细胞损伤,反而降低了y.表1火药弹,火药套管/加速管及滤网对籼稻y的影响"Tab?1Effectofpo~erload,distancefromDower∞uⅫ【omac:oprojecti.1e/macropmjeeti.1eflightdistanceandmeshesoDtransformationefficiencyofindicaric
9、e蓝点数?皿1)转化条件:品种为青风占12;产一0.OlMPa}靶距为6cm{d*=0.9m;m(DNA)r
