棉花基因枪转化体系的建立

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1、中国农业科学院硕士学位论文引言表1部分棉花遗传转化Tab

2、ejPanofCollongenetictransformation转化方法外源基因年代作者5中国农业科学院硕士学位论文引言1．2．2．2基因枪转化在棉花上的研究进展基因枪转化法没有宿主范围的限制，靶受体类型广泛，是继农杆菌介导法之后应用最广泛的一项遗传转化技术。目前，已有众多种植物采用基因枪转化技术获得了转基因植株，水稻、玉米、小麦。等作物均获得成功，该技术显示了旺盛的生命力和广泛的应用前景。但双子叶植物上较少应用，作为重要的经济作物棉花，此项技术的应用仅处于起步阶段。John等(1990)第

3、一次将此技术应用于棉花遗传转化中，他以胚性悬浮细胞系为受体进行轰击．成功得到转化植株：之后，Dennis等(1993)首次采用茎尖分生组织为受体进行转化，得到了经分子检测的转化植株。国内，吴敬啬等(1994)、朱卫民等(1998)以棉花茎尖分生组织为受体均获得了抗性转化植株；郝秀英等(1999)以棉花下胚轴为受体作了轰击探索。但以棉花幼胚、小孢子为受体进行轰击至今未见报道。(1)以茎尖分生组织为轰击受体以茎尖分生组织为轰击受体，通过器官再生完整植株的转化方法，国外已有报道。国内吴敬音、朱卫民等也进行了探索。此法最大的优点是克服了农杆菌宿主专一的限制，技

4、术直接，再生植株周期大大缩短，一般仅为6～16周即可得到转基因植株。技术路线：适龄无菌苗培养—制备茎尖分生组织一轰击一恢复培养一筛选培养(梯度筛选)一抗’眭转化植株一分子检测一嫁接一转基因植株。Dennis等以棉花商业品种、海岛棉(比马S6)、陆地棉和无腺体棉等多种材料进行了试验，晟后得到了正常可育的海岛棉和19个陆地棉转化植株，转化率为O．0270／o--4)．22％。他提出了“白抑现象”的理论，即当茎尖分生组织在培养一段时间后，则生长缓慢、失绿甚至死亡。他的研究结果表明，茎尖内部产生的ABA是造成此现象的原因之一。其改进措施为：培养基中加入flur

5、idone(ABA合成的抑制剂)或柠檬酸，可以在一定程度上缓解此现象。另一有效措旌是：0．3％的活性炭交替使用，先将茎尖转入含有活性炭的培养基，当其生长缓慢时，再移入无活性炭的培养基上2～3周，之后再转入含活性炭的培养基上，如此交替。可解决自抑现象。同时，活性炭还可以促进茎尖自发生根。但之后的同类研究中，未涉及白抑现象，然而活性炭促生长和生根的作用是不可忽视的。CarylA等(1995)以NPTII为外源基因进行了转化。他对卡那霉素进行了梯度实验(50、100、150、200mg／L)，以选取最适的浓度值。当筛选压为50m∥L时，非转化植株失绿死亡，而

6、转化植株的生长未受抑制；筛选压为100mg／L时，茎尖分生组织生长缓慢；筛选／玉,>100mg／L时，茎尖分生组织不能正常生根长芽。因此，最适筛选压为50m∥L。3个月内得到了正常可育的再生转化植株，转化率为O．885％。3．54％。吴敬音、朱卫民等对筛选程序中～些环节作了研究．茎尖培养基MS不加或仅加少量激素6中国农业科学院硕士学位论文引言优于高激素的，茎尖分生组织附带下胚轴长度为5—7mm为宜，最高筛选压卡那霉素70—100mg／L，他们也得到了抗生素抗性的转化植株，转化率为3．300／r-4．10％。一般认为，以茎尖分生组织为轰击受体转化率较低．

7、仅0．001“／04)．01％。而Agmw“(1997)、Gupta(1997)、Saeed(1997)、Hemphill(1998)和MOITe(1998)等提出的多茎尖诱导法，可在一定程度上提高基因枪转化法的转化效率。他们认为，子叶节、初生叶和再生n’1-较顶端分生组织更敏感，利用外源激素调控可使其产生3．4。8．3个茎尖。John报道，此方法可使转化率提高。另外，转化率是基因枪轰击过程中一系列综合因素的最终结果．因此，欲提高转化率必须使各参数达到最优，即建立一个良好的转化再生体系，这仍需要不断研究与探索。值得注意的是：茎尖分生组织转化中，极易产生

8、嵌合体。从解剖学角度讲，茎尖分生组织分三层：L1、L2和L3层。基因枪轰击时金属粒子进入L2和L3层后，可直接产生转化细胞：而若进入L1层，则仅表皮细胞发生转化，不能遗传给后代。基因枪转化法对茎尖分生组织的转化常限于引起表皮细胞的变化。吴敬音也认为，当微粒轰击茎尖分生组织时，只能有少数表层细胞被转化，而多数细胞未被转化，这种说法被普遍接受。而Trolinder(1988)提出的Spilt-medstemsMethod可以在一定程度上解决上述问题，其方法是劈开分生组织以暴露出L2层，增加L2和L3层被转化的机会。但此方法操作性要求极高。目前实验中是通过加

9、强筛选压力和延睦筛选时间，以保证转化组织真正含有外源基因，减少嵌合体的数量。(2)以胚性细胞悬