欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:28560613
大小:14.67 MB
页数:66页
时间:2018-12-11
《bi121lyzgfp基因表达载体的构建及其对紫花苜蓿愈伤组织的转化》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、甘肃农业大学2008届硕上学位论文摘要以紫花苜蓿不同品种(“甘农3号”、和田苜蓿、秘鲁苜蓿)为研究对象,进行了抗病基因对紫花苜蓿的转化的研究。筛选出了愈伤组织诱导的最佳培养基及其激素组合;构建了GFP(greenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白)和Lyz(1ysozyme,溶菌酶)基因的表达载体PBll21.Lyz—GFP;优化了农杆菌介导的苜蓿基因转化体系;并将抗病基因Lyz基因和报告基因GFP导入和田苜蓿中。对转化的愈伤组织进行了分子检测及荧光检测,证实了Ly'z基因和GFP已整合到苜蓿基因组
2、中并得到表达。主要研究成果如下:1、运用正交试验设计,建立苜蓿下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基。结果表明:对于秘鲁苜蓿和甘农3号苜蓿,最适愈伤组织诱导的培养基均为MS+2,4-D(2.0rag/L)+6-BA(0.5rag/L)+NAA(1.0mg/L),各因素影响程度皆为6-BA>NAA>KT。对于和田苜蓿,最适愈伤组织诱导的培养基为MS+2,4·D(2.0rag/L)+6-BA(1.0rag/L)+KT(1.0mg/L)+NAAfl.0rag/L),各因素影响程度为6.BA>KT>NAA。2、构建了GFP和Lyz
3、基因的植物表达载体PBll21一Lyz.GFP。将GFP基因插入到质粒载体PBll21.Lyz中,构建了含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体PBll21.Lyz.GFP,并通过液氨冻融法将其导入农杆菌LBA4404。3、遗传转化体系的建立。以培养7天的和田苜蓿的无菌苗下胚轴为外植体,以农杆菌菌株为介体,优化的基因转化体系如下:Kan筛选浓度定为40--50mg/L;抑菌剂选取Carb为宜,愈伤诱导阶段浓度为200mg/L;用于转化的侵染时间为10minl外植体预培养时间为3d;与农杆菌共培养3d。经筛选,得到69
4、块具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明重组基因已成功转化至4和田苜蓿愈伤组织中。关键词:紫花苜蓿;愈伤组织诱导;溶菌酶:绿色荧光蛋白;载体构建;遗传转化Ⅱ甘肃农业大学2008届硕士学位论文SummaryTakenthedifferentvarietiesofalfalfa(Gan-uongNo.3.皿sativacVXinjiangDaye,Peru)astheobjectsofstudywhichcarryingonthedisease-resistantgeneforthetransfo
5、rmationresearchofalfalfa.Selectedthebestculturemediumandthecombinationofhormonetoinductthecallus;ConstructedtheexpressionvectorPBll21··Lyz--GFPwhichcontainedtheGFPandLyzgene;O#anizedthetransformationsystemofalfalfathroughtheAgrobacterinm-mediatedandinductedthe
6、disease-resistantgeneLyzandGFPintotheHefianalfalfa,thetransformationofcallushadbeendetectedbythemolecularidentificationandthefluorescentmicroscopeanalysis,TheresultcoafLrmedtheLyzandGFPgenehasbeenintegratedintothegeuomeofalfalfaandexpressedsuccessfully.Themain
7、researchreadts啪asfollows;1.Toinducethecallusofalfalfahypocotyls.thehighefficientmediumwasestablishedbyorthogonaldesign.Thedataw@reanalysedbyvisualanalysisandvarianceanalysis.Theresultsshowedthat:MS+2,4-D(2.0mg/L)+6-BA(0.5mg/L)+NA.A(1.0rag/L)isthebestmediumforP
8、eruandGan-nongNo.3toinducethecallus,theeffectsequenceofthreeauxinsis6-BA>NAA>KT.MS+2,4-D(2.0m∥Lp6-BA(1.Om班卜KT(1.0mg/L州AA(I.0mg/L)isthebestmediumforMsativaCV.XinjiangDayetoinducethe
此文档下载收益归作者所有