花生pepc基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化

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1、花生PEPC基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化花生学报,:~“咒口,以“押已,.,.,文章编号:?一?花生基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化潘丽娟,迟晓元,陈娜,陈明娜,王通,王冕,杨珍,禹山林山东省花生研究所,山东青岛摘要:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是控制花生蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶。本研究利用方法扩增出了基因片段,并将其克隆到一载体,序列分析表明克隆片段的长度为。将该基因片段反向插入一双元表达载体,构建了带反义基因的双元载体并进行花生的转化,目前已获得转基因植株,收获代种子。关键词:花生

2、;基因;载体构建;遗传转化中圈分类号:..文献标识码:,?,,,,。,,口行竹口竹“
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”把,,矗口:/口户口口..?一..,?.,‘口户口.?.:;;;花生是我国重要油料作物之一,也是我国单因工程技术使人们能够按照意愿定向改良作物种产、总产和出口创汇最高的油料作物。提高花生性,克服了传统育种方法的不足,所需的群体小,籽仁含油量是花生育种的重要目标之一。植物基周期也短,为植物育种开辟了一条新途径?。生收稿日期:??基金项目:国家产业体系孓;.山东省自然基金;;;国家自然基金;;;山东省优秀中青年科学

3、家科研奖励基金;青岛市科技计划??一;???一;一卜?一一作者简介:潘丽娟一,女,山东潍坊人,山东省花生研究所助理研究员,硕士,主要从事花生遗传育种研究。通讯作者:禹山林?,男,研究员,主要从事花生遗传育种研究。:.万方数据花生学报卷物技术的发展,为利用基因工程提高花生含油量购自大连宝生物;感受态细胞购自北京天的育种工作奠定了基础。磷酸烯醇式丙酮酸羧化根生化;凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自酶控制油脂、蛋白质生物合成所需的共同公司。.底物磷酸烯醇式丙酮酸的流向,从而决定植物种引物的设计与产物的克隆子蛋

4、白质/油脂含量比例。磷酸烯醇式丙酮根据已克隆的基因登录号:酸羧化酶广泛分布在植物、藻类和细菌序列,设计一对带酶切位点的引物:中,但动物,真菌和酵母中没有发现¨。利用反一:王
至△堡△?义技术,抑制花生籽仁中基因表达,带酶切位点?一:至△

降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶量,使更多磷酸烯醇式丙酮酸流向脂肪酸的合成途径,为油脂合成带工酶切位点提供更多底物,可有效提高花生籽仁含油量。以保存的基因菌液为模板进行利用本实验室已获得的基因登录号:。扩增条件:℃变性;℃,℃序列,设计引物,经扩增,获得,℃,个循环;℃。将

5、基因片段,并构建了带反义基因的双产物回收并克隆到一载体上,转元表达载体一,通过冻融法转化大肠杆菌,蓝白斑筛选和鉴定阳化农杆菌,由其介导转化花生,获得转基性克隆,挑选正确的阳性克隆测序。.因植株,收获代种子,为进一步研究基因反义基因表达载体的构建受抑制后对花生油脂含量的影响打下基础。一的构建、质粒的提取、酶切、连接转化等具体操作方法参照文献凹进行。材料与方法将测序正确的单克隆转接到含氨苄青霉素的.试剂、材料培养基中℃振荡培养,提取质粒,用限制性本试验所用花生材料为花育号。植物转内切酶口和咒双酶切,得到基因

6、化载体,为本实验室保存;载体片段序列并切胶回收。用同样的酶双酶切植物双一、限制性内切酶施和户咒工元转化载体,切胶回收,连接载体酗最跏融榭噩。舢匦贰霉止主±匦她●一嗽卿翻饕鼬让国凡姆御占图反义表达载体崛一构建流程仃.万方数据期潘丽娟,等:花生基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化和基因片段,并转化大肠杆菌。转基因植株检测用引物为潮霉素磷酸转移酶基因反向插入到植物双元转化载体基因的特异性引物:中,获得反义表达载体??:’,一,载体构建流程见图。?:.反义基因表达载体对花生的遗传转化扩增条件:℃变性;℃,℃提

7、取一质粒,采用冻融,℃,个循环;℃。法转化感受态农杆菌,涂布于含有利结果与分析福平/、卡那霉素/的固体.基因片段的获得培养基平皿上,℃暗培养。挑取单菌以基因登录号:保存的落采用带有相同抗生素的液体培养基培养,采用法用引物一/一对菌液为模板,用引物一和一进基因进行检测,阳性克隆即为含有反义行扩增,获得一条左右的基因片段见图。基因表达载体的农杆菌工程菌株/一。将该片段回收后,与一载体转化方法参照文献略作修改。接种农杆连接,得到一?,转化大肠杆菌菌/一单克隆在含,挑选正确的阳性克隆测序。测序结果显利福平/、卡

8、那霉素/的示扩增得到的片段长,核苷酸序列比对结液体培养基中,℃振荡培养至值在.~果显示与基因序列一致。.反义基因表达载体的获得.之间。培养液离心悬浮后侵染预培养的受体将测序正确的一?单克隆,在含材料花生中胚轴,将外植体转移到氨苄青霉素的培养基中℃振荡培养,提取固体培养基上暗培养,然后转移到恢复培养基上,诱导分化,长出愈伤组织个周左右;随后质粒,用限制性内切酶口和靠双酶切,得到基因片段序列图,并切胶回收。将愈伤组织转移到筛选培养基上筛选,再经