抗寒基因表达载体构建及遗传转化研究

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1、西南农业大学硕士学位论文抗寒基因表达载体构建及遗传转化研究姓名：邓小燕申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：张兴国2003.5.1中文摘要抗寒是许多蔬菜和大田作物需要的一个重要农艺性状。，利用导入冷应答转录因子基因(CBF)来从转录水平上促进植物自身的大量冷诱导基因表达，并结合导入l～2个高效抗寒基因的策略，是当前植物抗寒遗传改良的基本方向，可能成为有效改善植物抗寒性的重．、要途径。》’一)7巧挝实验从探讨冷旱应答启动予P-RD29A冷诱导活性及冷诱导转录因子CBF3在常温下和低温下超表达时对转基因植株表型及抗寒性的影响等三个方面考虑，构建了相关抗寒基因

2、的三个植物表达载体。通过将携有RD29A-GUS-Tnos基因表达盒的载体pBIN*-RD29A-GUS转化黄瓜和小番茄外植体材料，检测GUS基西的瞬同表达活性，初步探讨了冷诱导启动子P—RD29A在这两种作物中是否具有冷诱导活性的问题．将植物表达载体pBIIT-35S—CBF3对黄瓜和小番茄进行遗传转化，建立了黄瓜高频再生和遗传转化体系，获得了一株转基因黄瓜植株，并通过了植物基因组PcR检渊；获得了两个具有Kan抗性的小番茄再生绿芽。主要研究结果如下：1冷诱导基因RD29A启动子片髋竹秉眙咻扮躺、．痒罚溽定及分析f根据拟南芥菜RD29A基因启动予两端．序

3、列设计随个特异引物P。(5’一ctgXc蛆agaatctcaaacacg一3．’)和&(5’一tGc∞t翘aagt匏tc姐acc．3’)，采用高保真的pfu—DNA聚合酶，从拟南芥(ArabYdopMsthaliana)Columbia生态型基因组DNA中，通过PCR扩增出目的片段。纯化钓目标产物经Ttul蜊^、聚合酶加气碱基后，采用TAClonging方法克隆到pUCm-T载体中。得到重组质粒pP-RD29A，转化大肠抒菌xLl-Blue，挑选白色的重组子菌落进行ColonyPCR筛选和质粒的酶切验证。挑选有插入P—RD29A启动子片段的重组子单菌落，委

4、托上海搏亚生物工程有限公司测序．结果表明，该目的片段为890bp，与发表的拟南芥菜P·髓29A(D13044)相应序列一致．，P—7，2转录爵予嘲基因的竞隆、序列灞定和分析7根据己发表的拟南芥转录因子翻忍基因序列设计两个特异性引物P。(5’一ag亡aaaccataccaacaaaaa-3’)和P．(5’一gtactaaae旧tggaaataataatctgag一3’)，采用与P-RD29A相同的方法进行克隆、序列测定和分析·获得的重组质粒命名为pCBF3，委托上海生工生物工程有限公司碧醮謦．结果表明，所克隆的嚣的片段为760bp，编码216个氨基酸，与发表

5、鹩拟南芥菜a婚基因(AF076155)相应序列及编码的氨基酸一致。，}一7+3植物表达载体的构建’’‘，i质粒pP-RD29A经PstI+庇畦{I双酶切后回收P根抛9A启动子，替换质粒pSAU2006中的CaMV35S启动子，建成携带RD29“嘴一Tnos基毽表达盒的中间载体pRD29A—GUS。pRD29A-GUS经Smal+Ec]136双酶切后，回收大片段，平端线型DNA自环化，构建成携带1RD29A-Tnos基因片段的中间载体pVCT201l。质粒pCBF3经BgllII单酶切后获得的目的基因片段础丹正确的插入到pVCT2011经BazaqI单酶切后

6、的线型载体中，构建成携带有RD29A—CBF3一Tnos基因表达盒的中问载体pVCT2012。质粒pSAU2006经Ba棚I+HindlII双酶切后回收CaMV35S启动子，pVCT2012经BglllI+HindIII双酶切后回收大片段，两片段经连接构建成携有35s—cBF3一Tnos基因表达盒的中间载体pVCT2014。质粒pBINPLUS经EcoRI+H／ndlII双酶切后回收大片段。质粒pRD29A—GUS、pVCT2012和pVCT2014分别经EcoRI+Hin矾II双酶切后回收目的基因表达盒片段RD29A-GUS-Tnos、RD29A-CBF

7、3-Tnos和35S-CBF3一Tnos，然后分别连接到线型pBINPLUS载体上，构建成植物表达载体pBIN'-RD29A—GUS、pBIN'-RD29A-CBF3和pBIN'-35S-CBF3。h一4冷诱导启动子P_R吆9^在黄瓜和小番茄中的冷诱导表达特性‘?以1天龄的黄瓜子叶和小番茄试管菌真叶为无菌外植体材料，分别经活化的农杆菌LBA4404(pBIN'-RD29A-GUS+p^L4404)菌液浸染后，暗培养32个小时，分别经5"C低温诱导和25℃常温处理后组织化学染色。结果表职，冷诱导启动子P-liD29A在黄瓜和小番茄中均具有冷诱导活性，受5℃的

8、低温诱导表达，而在25℃常温下不表达．■—、’7一／5植物表达载体