小麦叶绿体表达载体构建及遗传转化

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1、山东大学硕士学位论文小麦叶绿体表达载体构建及遗传转化姓名：高岭申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：侯丙凯;夏光敏20040519原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：)刍妊念日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印

2、件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名．、白碰念导师签名日期：衅硝／7日山东人学颂l‘学位论文小麦叶绿体表达载体构建及遗传转化摘要在植物基因工程研究中，质体是继核转化之后又一新的遗传转化和表达受体。质体转化体系具有可同时进行多基因转化：细菌的基因和很有应用价值的人类的cDNAs可以不经过密码子的修饰或重新合成而直接表达：外源基因表达水平高：后代遗传稳定：定点整合，不会产生基因沉默

3、及母性遗传，安全性好等优点。目前，叶绿体转化已在烟草、拟南芥菜、马铃薯、番茄和油菜(Brassicanapus和Lesquerellafendleri)等少数几种双子叶植物中获得了成功。而单子叶植物，仅在水稻中获得了转化植株，但叶绿体基因组没有达到同质化。小麦的叶绿体转化研究虽然有研究，但未构建定点整合表达载体，仅仅实现了瞬时表达。目前，已经导入叶绿体基因组的外源基因除了筛选标记基因以外，还有抗虫，抗旱，抗病，抗除草剂和一些药用蛋白的基因。由于质体转基因技术具有独特的优越性，它必将在生物技术领域引起一场新的革命。本实验通过分析小麦叶绿体基因组全序

4、列(GenBankAccessionNo．AB042240)，首次选定了rbcL和psa[基因间隔区作为外源基因的定点整合位点。用引物1和2扩增包括而吐基因的37端部分的约1．Okb的DNA片段，位置从基因组全序列的55744,--56767，长度为1042bp，以该DNA片段作为同源重组片段l：用引物3和引物4扩增包括完整的psaI和ycf4这两个基因在内的约1，5kb的DNA片段，位置从基因组全序列的56788-58284，长度为1515bp，以该DNA片段作为同源重组片段2：以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3’控制外源基因的

5、转录；分别构建了包含gfP报告基因和分别含有筛选标记aa矾、nptII和beta基因的小麦叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGY，pRNGY和pRCGY。由于叶绿体的原核性质，所构建的载体首先在大肠杆菌中检测其有效性。当用这些载体分别转化大肠杆菌后，通过激光扫描共聚焦显微镜和普通荧光显微镜均检测到了构建在表达载体中的gfP基因在大肠杆菌中表达所发出的强烈的绿色荧光，这表明构建在表达载体中的外源基因在具有原核性质的叶绿体中已实现成功表达。用基因枪轰击法将小麦叶绿体表达载体pRNGY导入小麦核生3号的愈伤组织：轰击过的材料在M&继代培养基上先恢复培养

6、一周，然后转到添加了150mg／L山东大学颀。l：学位论文巴龙霉素的MB：培养基上筛选6-8周，获得抗性愈伤组织。关键词：小麦：叶绿体转化：表达载体构建：gYP基因：定点整合：微粒轰击山东大学硕士学位论文ConstructionofChloroplastExpressionVectorandGeneticTransformationinWheatAbstractChloroplastgenomesdefiedthelawsofMendelianinheritanceatthedawnofplantgenetics，andcontinuetodef

7、ythemainstreamapproachtobiotechnology，leadingthefieldinanenvironmentallyfriendlydirection．Advantagesofincorporatingthetransgenesintheplastidgenomearc：containmentoftransgenesduetothelackofpollentransmission；expressionofmultiplegenesinoperons；highexpressionlevels；possibilityofe

8、xpressingunmodifiedbacterialgenesandhumancDNAs；targetedintegrationan