菠菜叶绿体表达载体构建及遗传转化

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1、山东大学硕士学位论文菠菜叶绿体表达载体构建及遗传转化姓名：耿晓霞申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：侯丙凯20090511山东大学硕士学位论文菠菜叶绿体表达载体构建及遗传转化摘要叶绿体是植物细胞内的重要细胞器，它的主要功能是进行光合作用。由于叶绿体基因组的拷贝数非常大，外源基因可以高效表达，所以它非常适合遗传转化。与核转化技术相比，叶绿体基因组转化有许多优点，比如外源基因表达效率高、安全性好、可以直接表达原核基因、可以实现定位整合，避免基因沉默现象和位置效应、可以同时表达多个基因、后代遗传稳定等。由于外源基因在叶绿

2、体中高效表达的特性，利用叶绿体转基因技术既可以进行作物遗传改良研究，又可以将叶绿体开发为绿色高效的生物反应器。叶绿体转基因技术起步相对较晚，到目前为止，高等植物的叶绿体转化体系仅在烟草、马铃薯、番茄、油菜、棉花、大豆、胡萝卜等几种植物中获得成功。最近，在水稻的叶绿体转化方面有了突破，尽管没有得到完全同质化的转化材料，但外源基因能够表达并可以传递给后代。目前还没有关于菠菜叶绿体转基因的报道，本论文首次开展菠菜叶绿体转化研究，为菠菜的遗传改良和开发绿色高效植物生物反应器奠定了基础。论文在以下几方面获得了重要结果：1．构建了

3、菠菜专用的叶绿体定点整合表达载体，并将构建的叶绿体载体转化进大肠杆菌，检测了载体的有效性。本实验首先通过分析菠菜叶绿体基因组全序列，选用了而以基因和accD基因的间隔区作为外源基因的定点整合位点。利用PER克隆方法，从菠菜叶绿体基因组中克隆了而以基因和accD基因的5’端部分，长度分别为1956bp和1320bp。以这两个DNA片段作为同源重组片段，以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3’控制外源基因的转录，构建了包含筛选标记基因aadA基因(编码氨基糖苷一3’一腺苷酸转移酶，具有壮观霉素和链霉素抗性)和报

4、告基因GFP(编码绿色荧光蛋白)的菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGA。由于叶绿体具有原核性质，所以可以在大肠杆菌中对构建的菠菜叶绿体定点整合表达载体进行功能验证。将构建好的菠菜叶绿体定点整合表达载体pRAGA转化到大肠杆菌DH5Q中，用488nm的蓝光激发，在激光扫描共聚焦显微镜下发现了大肠杆菌发出强烈的绿色荧光，而对照菌体没有荧光。实验表明G!即基因在原核大肠杆菌中已经成功表达，说明构建的菠菜叶绿体定点整合表达载体山东大学硕士学位论文pRAGA可以用于菠菜叶绿体转化。2．对菠菜进行了组织培养研究，探讨了组织再

5、生方法。本实验所用的材料为六种不同基因型的菠菜品种一日本春秋大叶菠菜(JDY)、大叶菠菜(DY)、春秋菠菜(CQ)、大叶菠菜华菠一号(HB．1)、伏特菠菜(FT)和超级全能菠菜(QN)。本实验主要研究了日本春秋大叶菠菜的叶片、下胚轴和子叶等外植体在几种不同的培养基的条件下的愈伤组织诱导和分化情况以及其它五种菠菜品种的子叶愈伤组织诱导和分化情况。研究表明，JDY的叶片的愈伤组织诱导率非常高，几乎能达到100％，但是叶片愈伤组织在分化培养基上没有分化，褐化情况很严重；JDY的下胚轴愈伤诱导率为93．75％，但是下胚轴愈伤组

6、织在分化培养基上同样没有获得分化苗：JDY的子叶在添加了6-BA和NAA的培养基上的分化率在80％以上，而且当6-BA为lmg／L，NAA为0．4mg／L时，JDY的子叶端部长出了分化苗，但是分化率很低，只有9．24％。其它五种菠菜的子叶在与JDY子叶同样的培养基上生长，愈伤组织诱导率都没有JDY高。QN的子叶在添加了lmg／L6-BA和0．4mg／LNAA的诱导分化培养基上也长出了分化苗，分化率大约为4．8％，而其它品种的菠菜子叶没有分化。3．采用基因枪轰击法对菠菜愈伤组织进行遗传转化，将菠菜叶绿体表达载体pRAGA

7、导入其中。轰击后的愈伤组织在继代培养基上恢复培养一周，然后转到添加80mg／L链霉素的培养基上初筛，再在添加100mg／L链霉素的培养基上进行第二轮筛选，目前此项工作正在进行中。关键词：菠菜；叶绿体转化；表达载体构建；定点整合；GFP基因；微粒轰击Ⅱ山东大学硕士学位论文TheConstructionofChloroplastSite—specificIntegrationExpressionVectorandGeneticTransformationinSpinach(SpinaciaoleraceaL．)ABSTRA

8、CTChloroplastcontainstheentiremachineryfortheprocessofphotosynthesisandtheirgeneticsystem．Comparedwithnucleartransformation，chloroplastgeneticengineeringhasshownconsi