玉米zmpot基因talen敲除和过表达载体的构建及遗传转化

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1、分类号０７於学當Ｓ２Ｑ１２１１３２．四川巧化大擎’．．．入．、；砸女学位论文玉米Ｚｗ户ｏｒ基因ＴＡＬＥＮ敲除和过表达载体的构建及遗传转化、宋攀．Ｖ－■Ｖ．．‘，—，＇指导教巧张志明研究员学轉专化生物化学与分子生物学研巧方向基因功能验巧－（‘Ｉ’■．．；？．：．■＇．．；．＇／■，＇■一－＇■＇．．，．Ｊ＿．．２０巧年６月－ｒ－Ｖ．，＊、ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉ

2、ｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｓｌ：ｅｒＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｔ）ｒｍａ村ｏｎｏｆＺ／Ｍ戶０ＪｅｎｅｉｎｇｍａｉｚｅｂｙＴＡＬＥＮａｎｄｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＰａｎＳ０ｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ（ｙｇｙ）－Ｄｉｒｅｃｔｅｄｂｙ：ＰｒｏｆｅｓｓｏｒＺＷｍｉｎｇＺｈａｎｇ？Ｊｕｎｅ２０１５，论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师

3、指导下进行研究工作所取得的，，学位论文中不包含其他个成果。尽我所知除了文中特别加ｔｉｕ示注和致谢的地方外人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机一构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。、年研究生签名；象）（乡月／合日关于论文使用授巧的声明目本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，Ｐ；学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可采

4、用影印、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不、缩印或扫描等复制手段保存同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本论文不保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。＿‘‘（请在上□内划小）研究生签名：女年６月乂曰导师签名：兴月年／《日始（｛矣《＾听中文摘要一容重是个重要的产量性状，也是作物超鳥产育种的重要目标性状。玉米容重能够真实地反映玉米的成熟度，、完整度、均匀度、巧粒结构紧实度和使用价值是玉米商品及加工品质的重要指标，是国际贸易中质量定级的重要因素，。长期＆来对

5、玉米品质的研究大多集中在如何提高营养价值和加工品质上，而忽略了商品品质尤其是容重对玉米品质的影响。对容重送个复杂性状的遗传基础研究不够深入，导致我国玉米，严重影响了国际市场的竞争力。课题组前期＆容重为研究对象容重改良进展缓慢，７一Ｌ一在玉米第号染色体上定位到个主效的ＱＴ，该ＱＴＬ区段内存在个重要的候选ＰＯＴ基因，命名为Ｚｍ。功能预测表明该基因编码ＰＯＴ家族蛋白，是氨基酸进入细胞内的关键膜转运蛋白。本研究构建了带有胚乱特异性启动子Ｇ７７的植物过表达载体ＣＵＢ－ＧＴＶ－ＺｗｆＯｒ－Ｗ及ＴＡＬＥＮ

6、敲除ＺｗｆＯｒ基因的载体ｐ。通过农杆菌介导法进，Ｗ期建立玉米ＴＡＬＥＮ敲除体系行玉米幼胚和胚性愈伤组织的遗传转化，并利用过表达及敲除技术研究Ｚｍｆｏｒ基因的功能。本研究取得如下结果：１．ＩＵＢ７３好粒总ＲＮＡ反转录的ｃＤＮＡ为模板，克隆了Ｚｗ尸ｏｒ基因。所克隆的Ｚｗｆｏｒ序列全长为２０８４ｂｐ，编码６４０个氨基酸，扩增的片段与Ｇｒａｍｅｎｅ数据库公布的该基因序列相似性为１００％。２Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法将胚乳特异性启动子仿７和目的基因分别连接到ＣＵＢ．用ｐ骨架载－－－，ＣＵＢＧ７７Ｚ

7、ｗＰ６＞ｒ６ｗ。经ＰＣ艮检测体上构建了植物表达载体ｐ、酶切鉴定及表达载体的序列分析表明，表达载体构建成功。３ＴＡＬＥＮ．为了保证敲除的特异性，我们在玉米ＺｗｆＯｒ基因的第二个外思子上设计了ＴＡＬＥＮ左右臂靴点。利用质粒文库试剂盒，将ＴＡＬＥＮ质粒模块分别构建到左右臂骨架载体上。４．分别酶切左右臂骨架载体和ｐＣＡＭＢＩＡＢＯｌ植物表达载体，再将ＴＡＬＥＮ左右臂模块连接到ＰＣＡＭＢＩＡＩ３０１植物表达载体上，经过酶切鉴定及模块序列分析表明，表达载体构建成功。５ＣＵＢ－ＧＴＶ－Ｚｍｆａｒ－ｔ

8、ｏｒ和ＴＡＬＥＮ敲除载体分别转化玉．通过农杆菌介导法将ｐＩ米幼胚组织和玉米胚性愈伤组织。经除草剂草甘麟和潮霉素締选后得到具有抗性的转基因植株，Ｗ幼胚为受体得到过表达载体的Ｔｏ代抗性植株９株，Ｗ愈伤组织为受体得到的ＴＡＬＥＮ敲除载体Ｔｏ代抗性植株１４６株。６ＰＣＲ检ＤＮＡ，．根据启动子区设计恃异引物，经测过表