patatin、wun1启动子驱动下ppo反义基因植物表达载体构建及马铃薯、烟草遗传转化的研究论文

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1、摘要Y937305多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)不仅与马铃薯抗病性有关，也与马铃薯块茎损伤褐化有关。如何保证地上植株具有较高的PPO活性，同时又能抑制块茎中PPO活性，减少块茎酶促褐变是马铃薯常规育种亟待解决的问题。本研究是在同源序列PPO反义基因PC3。ASPPOty植物表达载体基础上，利用生物技术构建由Patatin、Wunl启动子调控的PPO反义基因植物表达载体，初步探讨由Patatin、Wunl启动子调控的PPO反义基因植物表达载体在烟草中的转化和表达情况，为其在马铃薯上的应用提供依据。主要研究结果如下：1．设计

2、合成带有BamHI、SalI特定酶切位点的2对特异引物，通过PCR获得了1．1kb和1．2kb的扩增产物，将扩增产物与pMD一18T载体连接，得到了具有Patatin启动子和Wunl启动予的2个重组子pMD—P和pMD，W。对2个重组质粒酶切、回收和纯化短片段后连接到线性表达载体PC3一ASPPOty中，通过PCR及酶切鉴定，证明得到了所需要的2个反义基因表达载体pCP-ASPPOty和pCW-ASPPOty。通过直接导入法将反义基因表达载体质粒(pCP—ASPPOty、pCW-ASPPOty)导入农杆菌LBA4404；经PCR鉴定，此质粒已整合

3、到农杆菌Ti上。2．用农杆菌工程菌LBA4404+pCP—ASPPOty、LBA4404+pCW-ASPPOty、LBA4404+PCrASPPOty和LBA4404+PC3．ASPPOqe对烟草TJ2、马铃薯甘农薯1号和甘农薯2号进行遗传转化。烟草叶盘农杆菌侵染适宜浓度为0．5(OD600)，侵染最佳时间为5～8min，共培养2d出愈率和转化率最好；马铃薯茎段预培养2d，农杆菌侵染适宜浓度为0．5(0136∞)，侵染最佳时间为5min，共培养2d出愈率和转化率(抗性愈伤组织)最好。而卡那霉素敏感性实验结果表明，烟草叶盘选取100mg／LKan、

4、马铃薯茎段选取50mg／LKan作为选择压最为适宜。3．目前已获得含有全长序列PPO反义基因(PC3-ASPPOqc)、同源序列PPO反义基因(PC{-hSPPOty)、Patatin启动子驱动的同源序列PPO反义基因(pCP—ASPPOty)以及WtmI启动子驱动的同源序列PPO反义基因(pCW-ASPPOty)的转化烟草植株和“甘农薯1号”、“甘农薯2号”的转基因抗性愈伤组织。对转化植株进行PCR鉴定，证明为阳性植株。进一步生理检测和统计分析表明，Patain启动子驱动的PPO反义基因对叶片PPO活性的抑制效果不佳。而由CaMV35S启动子调

5、控的全长序列PFO反义基因、同涮芋列PPO反义基因和Wunl启动子驱动的同源序列PPO反义基因的转化烟草植株叶片的PPO活陛比对照明显降低。关键词：Patain启动子，wuIll启动子，PPO反义基因，植物表达载体，烟草，马铃薯，遗传转化SUMMARYPolyphenolOxidase(PPO)isnotonlyrelatedtoanti·diseaseofpotato，butalsorelatedtobrowningpotatotuber．Now，ithasbeenbecomeaurgentproblemthathowtoensurehighe

6、rPPOactivityofleavesinpotatobreeding，andlowerPPOactivitytodecreasethebrowningdegreeofpotatotuber．ThepresentstudywasbasedontheplantexpressionvectorofpC3．ASPPOtywithpartiesPPOantisensegenesequencetoconstructanewvectorinwhichCaMV35SpromoterwasinsteadedbyPatatinorWound·inducibleP

7、romoter．ThePPOactivityandbrowningintensityoftransgenictobaccoplantswithPatatinorWunlpromoterweretested，itprovidedbeneficialinformationforpotatobreeding．Themainresultswereasfollows：’1．TwospecificprimersweredesignedwhichwereaddedtotworestrictionenzymesitesBamHIandSalI．Twofragme

8、ntsofPCRproducts，1．1kband1．2kb，wereamplified，andthentheywereinserted