园艺植物遗传转化载体的构建

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1、第九章园艺植物遗传转化载体的构建主要内容根癌农杆菌Ti质粒基因转载体的构建发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的构建载体构建中常用的选择标记基因和报告基的因园艺植物常用的遗传转化载体类型目的基因与载体的连接根癌农杆菌一般只侵染双子叶植物。农杆菌属（Agrobacterium）有2种重要植物病原菌根癌农杆菌（Agrobacteriumtumerfaciens)携带有Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenesis）携带有Ri质粒(Root-inducingplasmid)在植物

2、基因转化的研究中，主要使用细菌质粒(大肠杆菌质粒，农杆菌质粒)和植物病毒作为载体。其中以根癌农杆菌Ti质粒转化载体是最为重要，是本章重点介绍的内容。冠瘿瘤病(根癌病)症状1、植物根及茎基部产生2、最初原因是受伤后引起alfalfa根癌农杆菌（Agrobacteriumtumerfaciens）发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenesis)第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建Ti质粒的发现历史1974年zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒，称为致癌质粒（Tumorinducingplasmid）,简称Ti质

3、粒.最初的发现和命名是1907年,Smith和Townsent发现双子叶植物常发生的冠瘿瘤是由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)诱发形成的.Ti质粒的遗传特性及类型Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为9.5×107～1.6×108，大小为180～250kb。迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它们的Ti质粒结构特性均有差别。根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，Ti质粒可被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆

4、碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。Ti质粒的基因位点及其功能区域Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右）（1）T-DNA区（transferred-DNAregions）:T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。（2）Vir区（virulenceregion）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合

5、所必需，它导致农杆菌产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH7个操纵子共24个基因。（3）Con区（regionsencodingconjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）,调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。（4）Ori区（originofreplication）:该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。LBRBTi质粒介导基因转化的原理1.植物受伤后会在伤口

6、分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α-羟基乙酰丁香酮等)。2.酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因(vir)表达:当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIRA蛋白传递给VIRG，VIRG激活其它vir基因(virB、virC、virD、virE)表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。3.T-DNA单链分子释放：virD基因编码一种核酸内切酶，先在T-DNA右边缘区(RB)切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。4.T-DNA单链分子转移到寄主细胞：T-D

7、NA单链分子与vir产物VIRD2蛋白共价结合，并在VIRD4和VIRB蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。Ti质粒介导基因转化的原理5.T-DNA整合到植物细胞的染色体中。T-DNA单链分子进入植物细胞后，在植物有关酶体系的催化下，互补的双链T-DNA分子,在RB序列的引导下，T-DNA分子整合到植物细胞的染色体中。6.T-DNA区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，T-DNA也被大量扩增，冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因表达后催

8、化合成冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。信号受体（VIRA）酚类物质诱导信号VIRGRBLB转移到寄主细胞整合到植物染色体中T-DNA单链分子释放VIRG激活virB、virC、virD、virE、vi