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1、高技术通讯2000121¹Patatin启动子驱动的乙肝表面抗原基因在马铃薯中的表达º»宋东光王光清汪训明(复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433)摘要按常规分子克隆方法将马铃薯中高表达的patatin启动子和乙肝表面抗原基因分别插入双元质粒pBI101成为植物表达载体pPHG9,由前者驱动后者表达;通过农杆菌转化法将乙肝表面抗原基因导入马铃薯并获得再生植株;用ELISA方法检测经PCR鉴定的转基因植株中乙肝表面抗原的含量,对照标准曲线得知转基因马铃薯植株中的乙肝表面抗原含量高达100~174n
2、g/mg可溶性蛋白。关键词马铃薯,patatin启动子,乙肝表面抗原基因,基因表达L1)品种Desiree无菌苗,由北京大学林忠平教授0引言惠赠。乙型肝炎病毒广泛感染人类,据估计,全世界112菌株及质粒TM有3亿以上乙肝病毒携带者。乙肝病毒可引起急慢农杆菌为LBA4404(BRL,Electromax)。按性肝炎和肝癌等致命性疾病,世界卫生组织目前已常规分子克隆方法将patatin启动子和乙肝表面抗将乙型肝炎纳入免疫计划。已有的研究发现乙肝病原基因(复旦大学遗传所李育阳教授惠赠)分别先毒外壳蛋白具有免疫原性,并已获
3、得可用作疫苗的后插入双元质粒pBI101(Clonntech)成为表达载乙肝表面抗原(HBsAg)。但无论是血清来源的乙体pPHG9,见图1。参照BRL操作说明采用电击肝表面抗原还是酵母发酵来源的重组乙肝表面抗法将表达载体导入农杆菌LBA4404。原,都很昂贵,因此对广大发展中国家来说,其绝113培养基大多数公民并不能因此受益,还将继续面临乙肝病YEB培养基:牛肉膏(5g/L),蛋白胨(5g/毒感染的威胁。L),酵母提取物(1g/L),蔗糖(5g/L),MgSO4为了能够大大降低生成乙肝疫苗的成本,1992(2mm
4、ol/L),pH710;无菌苗的培养基为:MS附[1]年Mason等提出了用转基因植物来生产疫苗的加016%琼脂和3%蔗糖,愈伤组织诱导及植株再设想,并实现了在转基因烟草中表达乙肝表面抗生培养基均为RB培养基:MS附加210mg/LZT、原,而且由此获得的乙肝表面抗原能引起小鼠的粘011mg/LNAA和3%蔗糖;离体块茎诱导培养基[2][3]膜免疫应答。Ehsani等将乙肝表面抗原基因TBC:MS附加110mg/LBAP(6-苄氨基嘌呤)、导入马铃薯并获得稳定表达,但表达量较低,仅为110mg/LZT(玉米素)、5
5、00mg/LCCC(矮壮65~85ng/mg可溶性蛋白。我们已经分离到了马素)和6%蔗糖上进行,22-24e,暗培养;植物培铃薯匍匐茎尤其是块茎中高水平的patatin启动养基的pH均为518-610。[4]子,本文报道将乙肝表面抗原基因构建于114农杆菌介导的马铃薯转化[5]patatin启动子调控之下,并通过农杆菌转化法将采用农杆菌茎段感染法转化马铃薯。转化其导入马铃薯,使乙肝表面抗原基因在马铃薯中得后的外植体接种于RB培养基(含有卡那霉素到高水平表达。50mg/L和头胞霉素500mg/L),培养条件均为25e
6、,光照16h,光强3000lx。转基因再生植株在1材料和方法TBC培养基上、暗培养条件下诱导离体气生块茎。111植物材料115转化植株的PCR检测[6]植物受体材料为马铃薯(Solanumtuberosum用CTAB法提取植物总DNA。用GeneAmp¹国家自然科学基金资助项目(39700092)。º男,1964年生,博士;研究方向:植物分子遗传学。»联系人。(收稿日期:1999-02-03,修回日期:1999-06-03))18)宋东光等:Patatin启动子驱动的乙肝表面抗原基因在马铃薯中的表达PCRsyste
7、m2400(PE公司)扩增HBsAg片段,设nos-ter上),PCR条件为:94e,5min;94e,40计引物1序列为:5.-CCAACCTCCAAT-sec,59e,40sec,72e,80sec,30个循环后72e,CACTCACC-3.(在HBsAg基因上),引物2序列2min,4e终止。为:5.-TAGTAACATAGATGACACCGC-3.(在图1质粒pPHG9的酶切图116HBsAg的ELISA检测料未显示)来看,高蔗糖浓度和暗培养是两个关键[2]根据Mason等制备样品:1g材料,液氮下研因素。
8、磨,加2ml提取缓冲液(20mmol/LNaH2PO4,212转基因植株的检测pH710,0115mol/LNaCl,20mmol/L抗坏血酸,取从卡那酶素抗性的转化愈伤上获得的再生植011%Triton-X100,015mmol/LPMSF),振荡株制备总DNA,然后进行PCR扩增,两个株系中15sec,冰浴10min,4e离心(8,000r/min,10
