乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和苜蓿中的表达

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1、山东省医学科学院硕士学位论文乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和苜蓿中的表达姓名：曲政申请学位级别：硕士专业：微生物与生化药学指导教师：王世立20100301乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和苜蓿中的表达乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和苜蓿中的表达研究生：曲政导师：王世立研究员专业：微生物与生化药学中文摘要目前，利用转基因植物生产药用外源蛋白已经成为低成本、大规模进行生物药物研究的主要思路之一。通过构建含有乙肝病毒表面抗原基因(HBsAg)的植物表达载体，并将其分别在烟草和苜蓿中表达，理论上，可以克服传统的通

2、过酵母表达系统得到乙肝疫苗生产过程中的工艺复杂、需要专门纯化设备以及成本较高的问题，为研制经济方便的口服乙肝疫苗提供了解决方法。针对植物中表达HBsAg表达量低的问题，本研究拟以构建复合式启动子的方法，利用烟草及苜蓿转基因探索其提高植物转基因表达量的可能性。本研究以植物表达载体pBI121为母核，利用分子克隆技术构建含有串联CaMV35S增强子的2EP启动子、HBsAg目的基因及NOS终止子表达盒的重组植物表达载体，利用液氮冻融法转化重组质粒pBll21．2EP至根癌农杆菌EHA，获得植物遗传转化工程菌pBI121／EHA；利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草和

3、苜蓿叶片外植体，在选择培养基上进行抗性筛选，经分化、壮大、生根等不同条件培养基培育，获得烟草和苜蓿的抗性植株；利用PCR、Westernblotting验证，证明HBsAg抗原基因已经整合进烟草和苜蓿基因组，并在抗性植株细胞内成功转录、表达HBsAg抗原蛋白。该研究进一步改良了植物表达载体，为获得高表达量的HBsAg抗原蛋白以及利用植物表达体系高效表达药用外源蛋白奠定了一定的技术基础。关键词：乙肝病毒表面抗原；植物表达载体；转基因植物；烟草；苜蓿山东省医学科学院硕士学位论文ConstructionofhepatitisBsurfaceantigen(HBs

4、Ag)GeneExpressingVectorsandItsExpressioninTransgenicTobaccomdAaccoanolfalfaIIaIIaGraduatestudent：ZhengQⅡInstructor：ResearchworkerShiliWangMajorin：MicrobiaIandBiochemiealPharmacyAbstractInthepresentstudy,thetransgenicplantexpressionsystemwasappliedtoobtaincompletemodifiedanddissolu

5、bleproteininalowcostandlargescaleway．TheproductionofhepatitisBvaccineisnowcarriedoutviayeastexpressionsystem，itsprocedureiscomplicated，itneedsspecialequipmentsanditscostisveryhigh．ThisproblemCanbesolvedthroughconstructingtheplantexpressionvectorcontaininghepatitisBsurfaceantigen(H

6、BsAg)geneandexpressingtheproteinintobaccoandalfalfa．ThismethodcallbeusedtoproducelessexpensiveoralhepatitisBvaccine．TosolvetheproblemoflowexpressionlevelofHBsAg，thisstudyplanedtoconstruct2EPpromoterandincreasetheproteinexpressionintobaccoandalfalfa．Usingmolecularcloningtechnique，H

7、BsAggeneWasinsertedintovectorpBI121toconstructplantexpressionvector．TheHBsAgexpressioncassetteincludeddoubleCaMV35Senhancer,HBsAgandNOSterminator．ThepBI121wasconstruedsuccessfully．RecombinantplasmidsweretransferredintoAgrobactriumtumefaciensEHA，andpBI121／EHAwereobtainedbyverifying

8、．Tobaccoandpurplealfalfaweretrans