杀虫基因高效植物表达载体的构建.pdf

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1、广西农业科学2010，41(9)：886—888GuangxiAgriculturalSciences杀虫基因高效植物表达载体的构建邓智年，魏源文，黄诚梅，潘有强，吕维莉，李杨瑞’(广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁530007)摘要：以质粒pCAMBIAl200、pBll21、pMMAR和pCl300MAR为基础，通过酶切连接，构建植物中间载体pC2MARHyg；再利用pAVAc质粒、载体pGAl611和中间载体pC2MARHyg，构建含有Ubi一1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR—AVAc。然后转化农杆菌EHAl05，经筛选鉴定

2、获得阳性克隆，为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。关键词：杀虫基因；植物表达载体；MAR序列中图分类号：Q782文献标识码：A文章编号：1002—8161(2010)09—0886-03Constructionofinsect-resistantgeneplantexpressionvectorDENGZhi-nian，WEIYuan-wen，HUANGCheng-mei，PANYou-qiang，LtiWei-li，LIYang-rui+(GuangxiCropGeneticImprovementandBiotechnologyLab，Nanning530007，Chin

3、a)Abstract：BasedonplasmidsofpCAMBIAl200,pBll21，pMMARandpCl300MAR，plantintermediatevectorpC2MARHygwasconstructedbydigestionandligation．PlantexpressionvectorpC2MAR—AVAccontainingUbi-1promoter,directduplicationMARsequenceandinsect-resistantgene(AVAc)，wereconstructedusingpAVAcplasmid，pC2MARHygvec

4、torandpGAl611vector．TheconstructedvectorWastransformedtoAgrobaeteriumEHAl05．Thenewlyconstructedplantexpressionvectorcallbeusedinmolecularbreedingprogramstailoredfordevelopinginsect-resistancecropplants．Keywords：insect—resistantgene；plantexpressionvector；,MARsequence甘蔗在生长期常受到各种病虫为害，严重影响甘蔗生产．致使

5、甘蔗特别是一些优质高产、高糖甘蔗品种产量和糖分下降，因而许多国家都投入大量人力和资金进行甘蔗抗病虫转基因研究。由于转基因在甘蔗中存在表达量过低、基因沉默严重、转化效率不高等现象，因此本研究在充分考虑抗虫基因表达量、基因沉默及抗生素选择标记等影响因素基础上．通过构建含Ubi—l启动子、潮霉素磷酸转移酶基因(UP73、顺向重复MAR序列和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR—AVAc，为下一步进行农杆菌介导的甘蔗抗虫转基因研究奠定基础。1材料与方法1．1试验材料1．1．1菌种和质粒质粒为pCAMBIAl200、pBll21、pGA161l,pC1300MAR,pMAR,pG

6、EM-3zf(+)和pAVAc．大肠杆菌DH50t．根癌农杆菌EHAl05由广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室保存。1．1．2酶和化学试剂酶、抗生素与试剂盒均为Promega、Roche、TaKaRa宝生物工程有限公司和上海生工生物工程技术服务有限公司产品。其他试剂均为国产分析纯。1．2试验方法1．2．1基本方法细菌培养、质粒提取、限制性内切酶酶切和连接以及大肠杆菌DH50t感受态细胞的制备和转化等均参照《分子克隆实验指南》[·1；根癌农杆菌EHAl05感受态细胞制备和转化、Ti质粒的提取参照《植物基因工程》‘21。收稿日期：2010-08—20基金项目：国家科技支撑计划课题

7、项目(2007BAD30802)；广西科技基础条件平台建设项目(09--007-08)；广西科学研究与技术开发计划项目(桂科能0815011--6一l，桂科攻10100005—9)；广西科学基金项目(桂科／j}0778006—6)；广西科学基金项目应用基础研究专项项目(桂科基0991021)；广西农业科学院科技发展基金项目(2007022)作者简介：邓智年(1976-)，女，广西南宁人，博士，副研究员，主要从事基因克隆和转基因研究工作。’为通信作者，E-mail：liyr@gxa