外源基因在马铃薯体内表达的研究

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1、摘要摘要本研究利用农杆菌介导法分别将禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因（H5HA）、麦芽糖乙酰基转移酶基因（MAA）和大肠杆菌腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）编码基因（glgC）导入马铃薯栽培品种Desiree中，对外源基因在马铃薯体内的表达情况进行分析，结果如下：1.将禽流感病毒H5HA基因分别与马铃薯淀粉结合型淀粉合酶I（GBSSI）基因启动子（Gp）、甘薯贮藏蛋白A（SpoA）基因的启动子（Sp）和花椰菜花叶病毒（CaMV）35S基因的启动子（35Sp）融合，构建了pBIN19/Gp-H5HA，pBIN19/Sp-H5HA和pBIN19/35Sp-H5HA三

2、个植物表达载体，研究不同启动子驱使下重组基因在马铃薯体内的表达。利用农杆菌介导的方法对马铃薯进行遗传转化，经新霉素磷酸转移酶（NPTII）抗性筛选后，Gp-H5HA系列共获得10株，Sp-H5HA系列共获得8株，35Sp-H5HA系列共获得12株。PCR结果表明，H5HA重组基因成功整合到马铃薯基因组中。除此之外，对35Sp-H5HA系列的10个转基因株系进行RT-PCR和Western斑点杂交分析，结果表明H5HA重组基因在马铃薯体内得到表达。2.从大肠杆菌中克隆了编码MAA的基因片段，并将该片段与环状芽孢杆菌环状糊精糖基转移酶（CGTase）的淀粉结合结构域（SBD）

3、连接，构建了在马铃薯GBSSI启动子驱动下的重组基因的植物表达载体pBIN19/MAA-SBD和pBIN19/SBD-MAA，它们分别用于MAA-SBD（SBD在C-末端）和SBD-MAA（SBD在N-末端）基因在马铃薯薯块中的表达。与此同时，构建了pBIN19/MAA对照质粒，用于检测MAA蛋白自身是否与淀粉粒之间有亲和性。利用农杆菌介导转化马铃薯，经NPTII抗性筛选后，三个系列共获得25个转基因株系，PCR分析结果表明，MAA和MAA/SBD重组基因已分别整合到马铃薯基因组中。3.将大肠杆菌中编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的glgC基因的序列与马铃薯GBSSI启动子

4、融合构建了pBIN19/glgC植物表达载体，利用农杆菌介导法转化马铃薯，经NPTII抗性筛选后，共获得10个再生株系。经PCR检测，其中9株为转基因植株。这一结果表明，glgC重组基因已转入并整合进马铃薯基因组中。本研究的结果对利用马铃薯作为生物反应器生产基因工程疫苗和对马铃薯淀粉分子结构改良，在马铃薯薯块中合成新型淀粉具有重要的理论意义和现实意义。关键词：马铃薯，生物反应器，H5HA，SBD，MAA，glgC，疫苗，新型淀粉IAbstractAbstractInthisstudy,H5N1subtypeavianinfluenzavirushemagglutining

5、ene(H5HA),E.colimaltoseacetyltransferasegene(MAA)andtheE.coliADP-glucosepyrophosphorylase(AGPase)codinggene(glgC)were,respectively,transformedintothepotatocultivarDesireebyusingAgrobacteriumtumefaciens-mediated.Theexpressionofgenesinthepotatowasanalyzedandtheresultsareasfollows:1.TheH5HA-

6、encodingcDNAfragmentwas,respectively,fusedtothepromoterfragmentsofpotatogranule-boundstarchsynthase(Gp),sweetpotatoSporaminA(Sp)andcauliflowermosaicvirus(CaMV)35S(35Sp).pBIN19vectorwiththeNOSterminatorwasusedforcloningtheH5HArecombinantgenes.pBIN19/Gp-H5HA,pBIN19/Sp-H5HAandpBIN19/35Sp-H5H

7、Abinaryvectorswereobtainedandtransformed,respectively,intoapotatocultivar(cv.Desiree)byusingAgrobacterium-mediadatetransformation.ATotalof10transgenic,root-formingshootsofGp-H5HAseries,8ofSp-H5HAseriesand12of35Sp-H5HAserieswereharvestedandmultiplied.PCRresultsshowed