外源基因在宿主细胞中的表达1.doc

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1、外源基因在宿主细胞中的高效表达-I影响外源基因表达的因素有效的转录起始•主要的限速步骤•选择强的可调控的启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体的首要问题启动子:位于结构基因5’端上游区的DNA序列,活化RNA聚合酶启动子的特征:序列特异性、方向性、位置特性、种属特异性举例说明原核生物的启动子和真核生物的启动子。启动子根据作用方式及功能分类：•组成型启动子(constitutivepromoter)：在个体的任何细胞中均有表达活性的启动子•诱导型启动子•组织特异型启动子最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的

2、启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或者由于产物表达而引起细胞死亡等问题。当细胞达到一定的密度，通过多种诱导使阻遏物失活，RNA聚合酶快速启动转录。原核细胞的启动子：lac,trp,tac,phoA,lPL,lPＲ都是这一类启动子（诱导型启动子，induciblepromoters)）。T7噬菌体启动子则是另一种类型的启动子，即组成型启动子（constitutivepromoters）。Ｔ７噬菌体启动子只为Ｔ７噬菌体的ＲＮＡ聚合酶所识别，而被Ｔ７RNA聚合酶所起始的转录非常活跃，使得由宿主细胞的RNA聚合酶

3、所进行的转录根本无法与之竞争，这样使细胞中几乎所有的转录都是由Ｔ７RNA聚合酶所操纵，在1-3小时内，目标基因的RNA转录水平可以达到rRNA水平。由于Ｔ７RNA聚合酶几乎能完整地转录在Ｔ７启动子控制下的所有DNA序列，所以近年来许多实验室开始选用Ｔ７噬菌体启动子进行外源基因的高效表达。Ｔ７启动子调控下的表达载体已经形成一个系列，根据外源基因的插入位点可以分别获得直接表达和融合表达。举例：•pET,pRSET•真核基因的表达调控要比原核复杂得多，然而启动子和增强子作为两个重要的转录调控序列，为外源基因在真核细胞中高效表达所必需•真核启

4、动子也分为：组成型和诱导型两大类•组成型启动子如：SV40、腺病毒、人巨细胞病毒（CMV）、Rous肉瘤病毒•诱导型启动子如：干扰素β启动子、热休克启动子、激素诱导的启动子mRNA的有效延伸和转录终止与基因的高效表达•外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题就是如何保证mRNA有效的延伸、终止和稳定的积累，尤其在真核细胞中•在转录物内的衰减（attenuation)和非特异性终止可以诱发转录中的mRNA分子的提前终止（prematuretermination）•衰减子（attenuators）具有简单终止子的特性，在原核细胞中处于生物合

5、成的操纵子的启动子和第一个结构基因之间•由于衰减子序列是负调控元件，为了保证mRNA转录完全，在表达载体的构建中要尽量避免其存在•色氨酸操纵子中的衰减子（attenuator）•正常的转录终止子的存在也是外源基因高效表达的一个因素，其作用是防止不必要的转录，使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性•为了防止mRNA在转录中的非特异性终止，抗终止序列元件（antiterminationelements）可以加入到表达载体上•对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和polyA加入位点，是外源基因高水平表达的重要因素mRNA的

6、稳定性与基因的高效表达•mRNA的稳定性直接关系到翻译产物的多少，提高其稳定性能提高基因表达效率•相关报道很少•对于原核细胞，利用RNase缺失的受体菌是一个可供选择的方案•对于真核细胞，可以按照基因表达调控中的原则，使mRNA5’端和3’端正确加工，提高成熟mRNA的稳定性•有效的翻译起始与基因的高效表达•翻译是mRNA指导的多肽链合成的过程•翻译起始是多种成分协同作用的过程，其中包括：mRNA、16SrRNA、fMet-tRNA之间的碱基配对，同时，还有核糖体S1蛋白和蛋白合成起始因子的相互作用•在原核细胞中，影响翻译起始的因素有

7、：起始密码子、核糖体结合位点（SD）、起始密码与SD序列之间的距离、核苷酸组成、mRNA的二级结构以及mRNA上游的5’端非翻译序列和蛋白编码区的5’端序列等。SD序列也即核糖体结合位点（RBS）的序列（是指原核细胞mRNA5’端非翻译区同16SrRNA3’端的互补序列）作为翻译起始，可以达到最大效率的一般原则是：（1）AUG（ATG）是首选的起始密码子（GUG、UUG、AUU、AUA有时也可用，但非最佳选择）（2）SD序列也即核糖体结合位点（RBS）的序列（是指原核细胞mRNA5’端非翻译区同16SrRNA3’端的互补序列）按照统计

8、学的原则，一般的SD序列至少含AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列的存在对原核细胞mRNA的转译起始非常重要（3）SD与起始密码之间的距离以9±3为适宜。也有报道指出如果SD序列同16SrRNA3’端的互补碱基大于8时