外源基因在宿主细胞中的

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1、Chapter9:High-levelexpressionofforeigngenes§1.genesilence§2.expressionsystemsofforeigngene§3.Isolatingandpurifyingtheproductofforeigngenes§1.genesilence(基因沉默)GeneSilencing?外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。.Genesilencingcanoccurateithertranscriptionallevel(TGS,TranscriptionalGeneSil

2、encing),orpost-transcriptionallevel(PTGS,Post-TranscriptionalGeneSilencing).TGS:MethylationInducedRepeat-InducedGeneSilencing(RIGC),positioneffect,andsoonPTGS:cosuppression,andsoonMethylationInducedHistone:组蛋白deacetylase去乙酰化酶基因表达系统原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系

3、统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。§2.expressionsystemsofforeigngene一、外源基因在原核细胞中的表达欲将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件：①通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并利用宿主菌的酶系统合成外源蛋白；②外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；③必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达；④外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(openreadingframe，ORF)；⑤利用宿主菌

4、的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。（一）基因表达的调控序列对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。1.启动子是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。-35Box和-10BoxTTGACATATAATTranscriptionalstartsite5’3’-35-1016-19bp5-9bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45原核细胞RNA聚合酶不能识别真核

5、基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。最佳启动子必须具备的条件①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。③应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3）-35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’①-35box②-10box（PribnowBox）Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列Plac

6、TTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGTPlLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAAT启动子tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。2．S-D序列mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。S-D序列(AGGAGG)后面的4个碱

7、基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。AUG左侧的三个碱基也有影响。-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。3．终止子在一个基因的3’端或是一个操纵子的3，端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／C的区域，G／C富含区域又具有