08第九章外源基因在真核细胞中的表达.ppt

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1、一、选择标记和报告基因二、DNA直接导入的基因转化方法三、农杆菌作载体的植物转基因方法四、外源基因转化在基因表达调控研究中的应用五、反义RNA及其在基因表达调控中的作用六、RNA干扰第九章外源基因在真核细胞中的表达一、选择标记和报告基因在将外源目的基因转化真核细胞时，必须分辨出哪些细胞被转化了，哪些细胞没有被转化。将一个选择标记与外源目的基因连接，被转化的细胞就带有选择标记。选择标记常用抗生素抗性基因，真核生物细胞所用的抗生素与原核细胞有所不同。真核生物细胞中的选择标记选择标记之一二氢叶酸还原酶基因二氢

2、叶酸还原酶（dihydrofolatereductase,DHFR）对于真核细胞核苷酸（胸腺嘧啶）的合成是必需的。对营养缺陷型dhfr－细胞来说，二氢叶酸还原酶基因可用作选择标记，在缺少胸腺嘧啶和次黄嘌呤的选择培养基中筛选出转化了的细胞。选择标记之一二氢叶酸还原酶基因氨甲喋呤（methotrexate,MTX）和三甲氧苄二氨嘧啶（trimethoprim）是二氢叶酸类似物，是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，当培养基中含有MTX时，二氢叶酸不能转变成四氢叶酸而生长受到抑制。有一种突变的DHFR，它不受MTX

3、的抑制，以它作选择标记，转化的细胞可在含MTX的培养基上生长。选择标记之二胸苷激酶基因tk－的宿主细胞在正常的培养基中可以生长，但在含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸苷（T）的培养基中不能生长。这是因为氨基喋呤抑制了二氢叶酸还原酶的活性，导致细胞不能合成TTP。若将tk＋基因转入细胞内，在HAT培养基中培养，虽然氨基喋呤抑制了核苷酸的从头合成途径，但培养基中的次黄嘌呤可以通过补救途径转变成ATP和GTP，胸苷通过胸苷激酶的作用可以转变成TTP（CTP可以按正常途径合成），所以被tk基因转化了的细胞可

4、以在HAT培养基中生长。选择标记之三新霉素磷酸转移酶基因新霉素磷酸转移酶基因（neomycinphospho-transferaseⅡgene,nptⅡ）是一个来源于转座子Tn5编码的分子量为25KD的酶，它催化许多氨基糖苷类抗生素（如新霉素、庆大霉素、卡那霉素、G-418）的磷酸化反应，将ATP上的γ磷酸基团转移到抗生素分子上，阻止了它们与靶位点——核糖体的相互作用，从而使这些抗生素失去对细胞的毒性。这类抗生素的毒理作用是与叶绿体及线粒体核糖体的30S亚基结合，阻止70S核糖体形成。选择标记之四潮霉素

5、磷酸转移酶基因潮霉素磷酸转移酶（hygromycinphospho-transferase，HPT）可使潮霉素B磷酸化而失去毒性。潮霉素B可抑制核糖体的功能，使细胞不能合成蛋白质，因此对大多数植物和动物细胞均有毒性。选择标记之五氯霉素乙酰转移酶基因氯霉素能抑制真核细胞线粒体中的蛋白质合成，而氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicolacetyltransferase，CAT）能使氯霉素乙酰化，从而失去毒性。选择标记之六抗除草剂基因除草剂PPT是一种谷氨酸类似物，它竞争性地抑制植物体内谷氨酰胺合成酶

6、（GS）的活性。谷氨酰胺合成酶催化下列反应，起到解氨毒的作用。当PPT存在时，GS活性被抑制，细胞内NH4+积累，细胞中毒而死亡。选择标记之六抗除草剂基因PPT乙酰转移酶（PAT）可以催化乙酰CoA分子上的乙酰基转移到PPT分子的游离氨基上，乙酰化了的PPT失去对GS的抑制作用，从而使转化了pat基因的植物表现出对PPT的抗性。用硅胶G薄层层析可以分离和分析乙酰化的PPT，从而测定PPT乙酰转移酶的活性，所以pat基因也可以当作报告基因。报告基因报告基因（reportergene）可用于研究基因调控和转

7、化基因的表达情况。报告基因一般是一种酶的基因，对报告基因的要求是在受体细胞中没有其产物，产物容易检测。报告基因之一β-葡糖醛酸糖苷酶基因β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）是目前应用最广泛的报告基因之一。它以x-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖醛酸）为底物，催化产生蓝色的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝沉淀，可用来观察转化基因的组织化学定位。还可以4-MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）为底物，催化产生4-甲基伞形酮，产物用荧光分光光度计测定，此法可测定基因表达的强度。

8、报告基因之二氯霉素乙酰基转移酶基因CAT也能用作报告基因。用14C标记的氯霉素、乙酰CoA与细胞、组织提取物反应，薄层层析法分离反应产物，放射自显影可测得CAT活性。氯霉素的结构式2,2-二氯-N-(1R,2R)-1,3二羟基-1-(4硝基苯基)丙-2-基乙酰胺氯霉素催化的反应及检测方法报告基因之三荧光素酶基因荧光素酶（luciferase，LUX）基因取自荧火虫或发光细菌，在ATP和Mg2+存在下，催化荧光素氧化发光。可用发光光度计测定。