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1、外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率综合性设计性实验-2第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测第二部分：毕赤酵母蛋白表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率此实验共包括如下三个部分在科研和临床中需要大量的蛋白质，这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后
2、加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichiapastoris,Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。毕赤酵母以甲醇为营养来源。由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗体等。第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测微观的酵母细胞5'AOX1启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达；α-因子信号
3、肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；HIS4为营养缺陷型筛选标志；3'AOX1基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组；抗Amp基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点1.载体的3'AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组表达载体与毕赤酵母基因组发生重组的两种方式：2.载体
4、的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组甲醇酵母系统高效表达影响因素载体稳定性：是整合还是粘附到酵母染色体上基因剂量：单/多拷贝甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型)，Mut+(利用甲醇快型)mRNA5′端：应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构AT含量：AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构表达产物稳定性：分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素外源基因的3'末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比较重要的因素，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组联合北京军事医学科学院李伍举教授
5、课题组建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。模型构建原理收集40例应用pPIC9载体在毕赤酵母GS115株中表达目的基因的数据。拟定以表达量100mg/L为界限，将40例目的基因表达水平分为高/低两组。确认表达载体的翻译终止密码子前后各100bp的序列，据此对每个数据构建200bp的片段。从上述每个基因的200bp片段，截取9,000个区间，截取方式为[X,Y],X和Y在200bp片段的范围为1≤X≤100,和111≤Y≤200。使用RNAfold软件对每个区间计算最低自由能，构建最低自由能矩阵。使用Tclass
6、程序对最低自由能矩阵进行t检验及判别分析，得到理论上可以判别表达水平高低的6个区间组合。我们将40例数据按75％的比例随机分成两组，多数组应用上述6个区间来建立判别函数，如此重复1,000次，这样我们得到了1,000个判别函数，如第一个判别函数为：HEG1=－20.20203＋0.52552X1－2.35843X2＋1.53122X3－2.24870X4－1.19898X5＋1.53908X6(1)LEG1=－14.37028＋0.00749X1－0.04135X2－0.87256X3＋2.02204X4＋0.15215X5－0.7449
7、5X6(2)这里的X1,X2,X3,X4,X5和X6分别代表区间[18,123]，[31,140]，[35,150]，[90,118]，[90,151]和[95,135]的用RNAfold软件计算的最低自由能（计算温度参数设为30℃）。对于每个新数据，为了预测该基因是否能在酵母中高效表达（表达水平大于100mg/L），可先计算这6个区间的最低自由能，然后运算上述的1,000个判别函数，来评估该基因高效表达的概率。如果在这1,000次的判别分析中，有500次或以上的HEG1大于LEG1，那么这个外源基因为一个表达水平大于100mg/L的基因
8、，否则就是个表达水平低于100mg/L的基因。外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页服务器http://ppic9.md.stu.edu.cn/ppic9分析流程：在“sequence
