巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略

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1、维普资讯http://www.cqvip.com海峡药学2007年第19卷第2期巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略骆诗鸿(厦门特宝生物工程股份有限公司厦门350005)摘要：巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一。要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量·必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。本文综述了应用该体系高效表达外源蛋白需考虑的策略关键词：毕赤酵母；高效表达；策略中图分类号：R92文献标识码：A文章编号：1006—3765(2007)02—

2、000404表达系统是基因工程及生物制药研究和应用的重要内达的各种因素，并阐述了优化外源蛋白在P．pastoris中高效容，也是生命科学研究领域的热点。长期以来，大肠杆菌一直表达的策略。被用作表达外源基因的宿主菌，并成功地表达了多种外源蛋1外源基因的内在特性白，但是它不能表达结构复杂的蛋白质，且分泌型表达产量较主要包括mRNA5’端非翻译区(5’一UTR)、基因的A+低。而哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂T组成和密码子的使用频率3个方面。5’一UTR的核苷酸序的真核细胞蛋白成分，但操作复杂，表

3、达水平低，产业化生产列和长度影响外源基因的表达，由于巴斯德毕赤酵母中乙醇造价昂贵，不易普遍推广使用。酵母是单细胞低等真核生物，氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的3O％以上)，极少有它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高外源蛋白能达到这么高的水平，因此为了有高的蛋白表达量，密度发酵等特性，同时又具有适于真核生物基因产物正确折维持外源基因mRNA5UTR。尽可能和A0XlmRNA5一叠的细胞内环境和糖链加工系统，还能分泌外源蛋白到培养UTR相似是必需的，最好是保持两者一致。A+T含量高的液中，利

4、于纯化。因此，最近10多年来，酵母被认为是一个很基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止，有前途的真核表达系统而受到广泛的关注由于发酵和酿造这是因为AT丰富区可能存在转录提前终止信号。因此对工业的发展，人们对酿酒酵母的遗传背景和生物学特性研究AT含量丰富的基因最好是重新设计序列，使其A+T含量得比较透彻，且其表达的安全性易被接受。因此，酿酒酵母首在3O％～55％范围内。用这种方法使破伤风毒素C片段得到先被用来作为外源基因的表达宿主菌，然而其表达重组蛋白高效表达。Patn等通过对110个酵母基因使用密

5、码子的统计有一定的局限性。基于酿酒酵母的局限性，人们用其他酵母菌学分析，确证了密码子的偏爱性与基因的表达量密切相关。在株构建了可高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码养型酵母表达系统。作为第2代酵母表达系统，它克服了酿酒子。赵翔等通过分析巴斯德毕赤酵母的28个蛋白编码基因的酵母表达系统的诸多不足，成为国内外广泛应用的大量生产同义密码子使用情况，计算出该酵母的密码子用法，并确定出外源真核或其他结构较为复杂的原核蛋白的一个较为理想的巴斯德毕赤酵母的19个高表达

6、优越密码子“。表达系统。毕赤酵母是一种单细胞真核生物，近十年来被作为2选择强启动子真核表达系统而用于外源蛋白质的生产，作为一种成功的表P．pastoris载体中最常用的启动子为AOXl启动子，它的达体系，其优点在于：具有强有力的甲醇氧化酶基因(AOXI)甲醇诱导性很强，因此，由它控制的外源基因通常能得到高效启动子，可严格调控外源基因的表达；能高密度发酵培养，而表达。也有人曾用P和Po^s启动子，但二者的强度大大低且营养要求低，利于工业化放大生产；自身分泌的蛋白质非常于P。如果带有外源基因的载体通过双交换整合P

7、．少，使高分泌的外源蛋白质便于纯化；外源基因通过整合型质pastoris的AOX1基因位置时，AOX1基因将被破坏。虽然粒进入毕赤酵母染色体基因组，结构稳定，不易丢失}自身含AOX2和AOX1基因的序列同源性高达97％，但AOX1基因有亚细胞器结构，可对表达的蛋白质进行翻译后的修饰如信表达产物在正常细胞中仅占总酶量的5％。这样就使细胞利号序列的加工；蛋白质的折叠；二硫键形成以及糖基化；基因用甲醇的能力大大下降，从而使表达下降且延长了细胞发酵表达的产物既可在胞内积聚，又可分泌到胞外；外源蛋白质的时间。为了克服这

8、一缺点，戴秀玉等通过分离选择恢复利用表达量较高，如转化酵素2．3g·L_。，牛溶菌酶CO，55g·甲醇能力的自发突变体，从AOX1基因缺陷菌株中分离得到L一。溶栓酶0．08g·LI。，A一淀粉酶2．5g·L一，果胶裂解酶Mut+的自发突变体，他们对突变体的AOX2基因上游区域0．O04g·L一。破伤风毒素片段C12．Og·L～，百日咳抗原经PCR扩增产物测序、确定了该突变体在一255和一529两P6