巴斯德毕赤酵母表达系统优化策略

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1、!"卷#期微生物学报%&’(!"-&(##$$"年!月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$)*+,’#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!巴斯德毕赤酵母表达系统优化策略李洪钊李亮助孙强明!宏映"（中国医学科学院医学生物学研究所昆明CA$>>D）!"#$"%&’%()*#+,"’-’.’/&.&"/&$0$1#(’&101,#%((’*/!2("%-"E,F&32B41&E,E,132B4=G=3H,1320,32I132F&325,32（!"#$%$&$’()*’+%,-./%(.

2、(01，23%"’#’4,-+’51()*’+%,-.6,%’",’#，7&"5%"0CA$>>D，23%"-）关键词：巴斯德毕赤酵母，表达，优化策略中图分类号：H@DC文献标识码：)文章编号：$$$>/C#$?（#$$"）$#/$#DD/$A巴斯德毕赤酵母（8%,3%-9-#$(:%#，J*）表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。J*的如下优点是促成此表达系统在近十几年里迅速发展和被广泛应用的重要原因：J*为单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；J*的醇氧化酶（>)’8&4&’KL,<1;:>，4;<>）基因的启动子具有强诱导性和强启

3、动性，适于外源基因的高水平诱导表达；J*具有强烈的好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；J*可高水平分泌表达外源蛋白，纯化方便；J*具有真核细胞的翻译后修饰功能。迄今已有#$$多种外源蛋白在J*中获得表达。但也有许多蛋白表达不理想，甚至不能表达。要实现目的蛋白在J*中的成功表达并兼顾其实用性和安全性，必须充分考虑影响表达和应用的各种因素并采取有效的优化策略。3目的基因的特性目的基因的特性是决定表达成败的首要因素。许多高)MN含量的基因由于成熟前终止而不能有［>］效转录。特定的)MN富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号，导致仅产生低水平或截短的0O

4、-)。某些稀有密码子，尤其是稀有密码子密集区往往成为制约翻译速率的因素。目的基因特性对表达的影［#］［"］响被认为是一种具有种属特异性的现象。在某些情况下，可通过定点突变去除成熟前终止结构域［!］和替换稀有密码子。但在更极端的情况下，即基因中存在大量)MN富含区和稀有密码子密集区时，［A］往往需要进行全基因合成，使编码序列符合J*偏爱性密码子用法和具有更高的IM9含量。4启动子选择［C］最广泛应用的启动子J)KP（>醇氧化酶>启动子），是由甲醇诱导的强启动子。在某些情况下J)KP>的使用受到限制，例如：甲醇不适用于食品工业生产，也是一种火灾隐患。故其它不用甲醇诱导的

5、启动"通讯作者。./01,’：21324&325,3264&701,’(8&0"9&++:;*&3<,321=74&+(./01,’：21324&325,3264&701,’(8&0作者简介：李洪钊（>?@#/），男，天津人，中国医学科学院医学生物学研究所在读硕士研究生，>??A年毕业于南开大学生命科学院生物化学与分子生物学系，现主要从事基因工程药物方面的研究。./01,’：4&32B41&’,64&701,’(8&0收稿日期：#$$#/$!/$A，修回日期：#$$#/$?/>@2期李洪钊等：巴斯德毕赤酵母表达系统优化策略2*-子也引人注目。［$］!"#（!三磷酸甘

6、油醛脱氢酶启动子）是一种组成型强启动子。使用!"#!在发酵时不需甲醇诱导，不必更换碳源，工艺简单。但!"#!不宜用于表达对!%有毒的蛋白。!&’(（)依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶启动［*］子）在以甲醇为单一碳源或以甲胺为单一氮源时，被强烈诱导。使用!&’()可选择以甲醇或甲胺（一种廉价的无毒氮源）诱导高水平表达，为选择符合实际应用要求的启动子提供了灵活性，也扩大了!%的应用范围。在!#+,)、!"#!、和!&’()这些强启动子的驱动下，某些外源蛋白的表达水平过高，超过了宿主细胞翻译［-，).］后处理加工能力所能承担的最大负荷，引起蛋白的错折叠、不加工或错定位。此时或在其

7、他一些应［))］用情况下，需要选择较温和的启动子，如!!/,（*一种过氧化物酶体基质蛋白启动子）和!0!1（)一种"1!［)2］酶启动子）。!345#的非翻译区（614）614对蛋白表达的影响主要表现在345#的翻译水平上。!"#)345#的7’614长))89:，富含#;6。目的蛋白345#应尽可能具有与!"#)345#相近，最好是相同的7’614。一般地，目的基因编码序列的第一个#1"应尽可能接近，最好处于!"#)#1"的位置，此位置对应于大多数载体多克隆位点的第一个限制酶切点处。<=>>?=@AB9C等通过调整人血清白蛋白345#与!"#)345#的7’6