信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质影响

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生物化学与生物物理学报ISSN058229879ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICA2003,35(2):154-160CN3121300/Q信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响311熊爱生　彭日荷　李　贤　范惠琴　姚泉洪　郭美锦　张嗣良(上海市农业科学院生物技术研究中心、上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;1华东理工大学生物工程学院,上海200237)摘要　　乙醇氧化酶启动子被分离、克隆,并建立了转化方法后,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达,对信号肽序列进行了研究。首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I,随后在MF4I信号肽序列的N端分别引入1～10个毕赤酵母Aox1蛋白质的N端氨基酸,构成10种不同的分泌信号肽序列,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加,而以N端增加A、I、P三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比,使植酸酶分泌表达量增加5倍,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为90mg/L。此外在MF4I信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了EEAEAEAEP和K共10个氨基酸,进一步提高信号肽的分泌效率,使表达又提高约35%,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到120mg/L,是pPCI9K表达量的8倍。关键词　　毕赤酵母;信号肽序列;表达载体;高效表达　　毕赤酵母(Pichiapastoris)系统是近年来发展很的5′非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译。维快的一个真核表达系统,许多有活性的蛋白质已经持外源基因mRNA5′2UTR尽可能和Aox1mRNA的在毕赤酵母系统中大量表达。毕赤酵母在缺乏抑制5′2UTR的相似是必需的。通过人血清白蛋白(HAS)性碳源如葡萄糖、甘油时,能以甲醇为唯一碳源生和Aox1mRNA的5′2UTR一致,使HSA基因的表达[5]长。毕赤酵母表达系统是真核表达系统,可以对表量提高了50倍。酿酒酵母α交配因子(MFα)信号达的蛋白质进行加工折叠和修饰,还具有发酵方法[6～9]肽在酵母表达外源蛋白质中广泛使用,研究显成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既示在MFα中间插入EEAEAEAEPK共10个氨可以胞内积累又可分泌;表达产量高、背景蛋白质基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分少、易于表达产物纯化等优点。[10]泌效率提高了2倍以上。偏爱密码子的使用能够　　近年来,许多蛋白质在毕赤酵母中实现了高效较大幅度提高植酸酶基因的表达水平[11]。Aox1启表达,达到了克级水平,部分达到了十几克的高表动子能够高效启动Aox1基因在毕赤酵母中的表达,[1,2]达;但仍然有多种的蛋白质表达量相对较在信号肽的起始密码子ATG后增加Aox1基因ATG[3,4]低。提高毕赤酵母外源蛋白质的表达量是降低后的氨基酸序列能够提高目的蛋白质的表达量。工业化生产成本的关键。　　本文研究了信号肽序列调整对外源蛋白质在毕　　在菌株、培养条件、发酵等逐渐成熟的情况赤酵母系统中表达的影响。通过连续延伸PCR技下,构建高表达的载体是提高外源基因表达量的一术[12,13]按酵母偏爱设计并合成了信号肽序列,研究个关键因素。mRNA5′端非翻译区(5′2UTR)的核苷了各种调整对表达的影响。酸序列和长度影响外源基因的表达。一个适当长度1　材料和方法(MaterialsandMethods)收稿日期:2002208221　　接受日期:20022102161.1　材料上海市科委重大项目(No.993913002)和上海永业农科生物工程公司资助1.1.1　菌株与质粒　　毕赤酵母菌株[Pichiapas23联系人:Tel,021262205704;Fax,021262209988;e2mail,+toris(His2Mut)]购自美国种质保藏中心(ATCC)。yaoquanhong@yahoo.com大肠杆菌菌株E.coliDH5α、质粒pBluescriptSK等©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net Feb.,2003熊爱生等:信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响155为Promega公司产品。质粒pPIC9K为Invitrogen公司物素、20g/L葡萄糖、15g/L琼脂糖)平板上,30℃产品。培养2天,在MD上生长正常而在MM上生长不正1.1.2　试剂耗材　　PCR引物由上海生工公司合常或不生长的转化子为阳性克隆。成,限制性内切酶、T4连接酶和PyrobestDNA聚合将阳性克隆分别对应划线于MD和G418浓度酶为TaKaRa公司产品。DNA测序试剂盒购于Phar2为0.5μg/LMD平板上进行单拷贝的筛选。含G418macia公司。G418、脱糖基化试剂EndoH、植酸酶检MD平板上不生长,MD平板上生长的为表达单元单[19]测试剂(植酸钾钠、钼酸胺、偏钒酸胺)以及植酸酶拷贝的克隆。纯品购自Sigma公司,其他化学试剂均为国产AR1.2.5　重组酵母的培养及诱导表达　　将重组酵级。母接种于20mLBMGY(10g/L酵母提取物、20g/L1.2　方法蛋白胨、13.4g/LYNB、0.4mg/L生物素、10g/L1.2.1　信号肽序列的化学合成　　根据GenBank甘油),30℃培养,离心收集菌体,加入20mL诱导[14][15](Z46233)的信号肽序列和Aox1基因的氨基酸培养基BMMY(用0.5%甲醇代替BMGY中的甘[16]序列,按照酵母偏爱密码,设计合成引物。引物油),30℃下继续诱导培养36h。从两端开始设计,5′端到中间为正向引物,3′端到1.2.6　高表达菌株筛选及SDS2PAGE电泳分析　中间为反向引物。两条引物之间存在20～25bp的将所有的阳性克隆分别单独接种到试管中,30℃重叠序列(表1)。基因合成采取连续延伸PCR方法培养至A值达到3左右,再利用0.5%甲醇诱导培[12,13]进行(图1)。养36h。每个诱导菌株取5μL上清液进行SDS2[17]1.2.2DNA操作　　基因工程操作根据文献进PAGE并且结合植酸酶活性测定筛选高表达菌株。行。制备的双链质粒DNA在ABI377型DNA自动化分别将各构建的高表达菌株接种到三角瓶中,30℃测序仪上进行序列测定。测序工作在上海市农业科培养至A值达到4～5,再利用甲醇诱导培养36h。学院生物技术研究中心植物基因工程研究室完成。每个诱导菌株取10μL上清液进行SDS2PAGE检测,1.2.3　酵母各表达载体构建　　分别将修饰过的分析蛋白质的表达量。信号肽序列,用HindIII和XhoI双酶切,定向插入酸性植酸酶在毕赤酵母中表达时,糖基化程度[18][20]表达酸性植酸酶的酵母表达载体中,构建不同较高,蛋白质电泳条带较为复杂。含约100μg酸信号肽的酸性植酸酶重组质粒。性植酸酶蛋白的发酵上清液中加入3000u的EndoH1.2.4　酵母的电击转化及筛选　　将活化的毕赤进行脱糖基化处理,37℃水浴5h,进行SDS2PAGE[21]酵母于500mLYPD(20g/L蛋白胨、10g/L酵母提电泳。取物、20g/L葡糖糖)中30℃培养18h,至A值达　　以植酸钾钠为底物进行酶活性测定。植酸酶酶[22]到1.7,5000r/min离心收集菌体,先后用500mL、活性测定方法采取钼黄法。植酸酶酶活性单位250mL预冷的无菌水洗菌体,离心去上清液,用20(u)定义为:在37℃下,每分钟分解植酸盐释放出mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再1nmol/L无机磷酸所需要的酶量为1u。用0.5mL预冷的山梨醇悬浮,用于电击。大量抽提酵母表达质粒,BglII酶切回收小片2　结果(Results)段,取2μg线性化片段加入50μL感受态细胞,冰2.1　不同信号肽序列的合成与序列测定浴5min,用Bio2RedGenePulser电击仪电击,参数为　　通过图1所示连续延伸PCR,利用表1的引物,2.5kV,25μF。电击结束后,立即加入1.0mL预冷再利用高保真的PyrobestDNA聚合酶合成了15条的1.0mol/L山梨醇,取200μL涂布于固体选择培信号肽序列,分别编号为:XHT1、XHT2、XHT3、养基平板[186g/L山梨醇、20g/L葡萄糖、13.4g/XHT4、XHT5、XHT6、XHT7、XHT8、XHT9、XHT10、L酵母氮源基础培养基(YNB)、0.05g/L谷氨酸、XHT11、XHT12、XHT13、XHT14和XHT15(表2)。0.05g/L甲硫氨酸、0.05g/L赖氨酸、0.05g/L亮XHT1消除了ATG密码子前的BamHI酶切位点氨酸、0.05g/L异亮氨酸、20g/L琼脂糖],30℃培(GGATCC),使得启动子与信号肽序列间直接相连,养直至转化子出现。用牙签将转化子对应点种到没有使用酵母偏爱密码(notuse2MM(13.4g/LYNB、0.4mg/L生物素、5g/L甲醇、biascodon),该调整对表达有促进作用。XHT2～1515g/L琼脂糖)和MD(13.4g/LYNB、0.4mg/L生©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net 156ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICAVol.35,No.2Fig.1ThenucleotidesequenceofsignalpeptidesynthesisbysuccessivePCREachofchemicallysyntheticoligonucleotideswasabout90bp.Alltheseprimerscanassembledcorrectlybyone2stepPCRwhen1-2nginnerprimersand100-200ngexternalprimerswereblendedtogether.ThosePCRexternalprimerscontainsuitablerestrictioncleavagesitesforcloning.均使用了酵母偏爱密码(usebiascodon)。XHT3是没Fig.2Comparisonofnucleotidesequencesbetweensynthetic有消除BamHI酶切位点,XHT4消除了BamHI酶切signalpeptidesequenceandthesequencefrompPCI9K位点。XHT4～13消除了BamHI酶切位点,同时在TheunderlinedregionaredeletedthesiteofBamHI.Theboxedregionen2codesA、I、P、E、E、F、D、I、LandVaminoacidresidues.Thelower2信号肽MF4I启始密码子ATG后分别增加了毕赤酵caseregioninboldencodesEEAEAEAEPKaminoacidresidues.母Aox1基因ATG后的1～10个氨基酸,分别为A、I、P、E、E、F、D、I、L和V。以全合成酸性植酸酶码、信号肽与启动子直接相连,在相应的位置插入为例,上述氨基酸的加入均可提高外源基因的分泌AIP和EEAEAEAEPK等氨基酸,以进一步表达量,以插入AIP三个氨基酸的表达量提高最提高信号肽的分泌效率。分别将它们克隆到pBlue2大。另外在MF4I信号肽的引导序列和内切蛋白酶scriptSK载体,采用双脱氧核苷酸终止法进行DNA间增加了EEAEAEAEPK共10个氨基酸,提测序,结果表明合成的信号肽序列与设计一致,与高信号肽的分泌效率,XHT14对表达提高的作用明报道的信号肽序列有了不同程度的改动(图2)。显。优优组合,将几方面的提高因素结合,2.2　含不同信号肽的高效表达载体的构建合成XHT15,具有以下特征:采用了酵母偏爱密Table1PrimersforenzymaticsynthesisofsignalpeptidesequenceTheunderlinedregionsareHindIIIandXhoIsites.TheboxedregionencodesA、I、P、E、E、F、D、I、LandVaminoacidresidues.TheshadowedregionencodesEEAEAEAEPKaminoacidresidues.©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net Feb.,2003熊爱生等:信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响157Table2ThenameandcharacterizationofthefifteenconstructionofplasmidsCharacterizationofthesignalNamePrimersHindIIIATGXhoIacidphygenepPCI9KXHT1S11、S21AAAAACG(MRF)NotusebiascodonXHT2S11、S3、S5、S6、S4、S2AAGGATCCAAACG(MRF)UsebiascodonXHT3S1、S3、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MRF)UsebiascodonXHT4S1、S31、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MARF)UsebiascodonXHT5S1、S32、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIRF)UsebiascodonXHT6S1、S33、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIPRF)UsebiascodonXHT7S1、S34、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIPERF)UsebiascodonXHT8S1、S35、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIPEERF)UsebiascodonXHT9S1、S36、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIPEEFRF)UsebiascodonXHT10S1、S37、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIPEEFDRF)UsebiascodonXHT11S1、S38、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIPEEFDIRF)UsebiascodonXHT12S1、S39、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIPEEFDILRF)UsebiascodonXHT13S1、S310、S5、S6、S4、S2AAAAACG(MAIPEEFDILVRF)UsebiascodonXHT14S1、S33、S5、S6、S41、S2AAAAACG(MRFEEAEAEAEPK)UsebiascodonXHT15S1、S33、S5、S6、S41、S2AAAAACG(MAIPRFEEAEAEAEPK)Usebiascodon+　　将按照酵母偏爱全合成的酸性植酸酶基因通过生长。通过这一标记,筛选得到各质粒大量的HisXhoI和NotI插入pPCI9K载体中,构建酸性植酸酶转化子,每种组合均筛选200个左右。通过同源重原始表达载体。再分别将15条不同的信号肽序列组,将植酸酶基因表达单元整合到酵母染色体上,通过HindIII和XhoI酶切后定点插入表达酸性植酸整合会破坏受体酵母的醇氧化酶基因,重组酵母在酶的表达载体pYPX98,构建不同信号肽的酸性植以甲醇作为碳源的培养基中不能正常生长。用甲醇酸酶重组质粒,共有15种(图3)。酶切和测序鉴定为碳源的MM培养基和以葡萄糖为碳源的MD培养构建正确。基进行对应培养,进一步筛选得到各质粒的重组转2.3　毕赤酵母的电击转化筛选化子,每个构建均得到30多个转化子。将16种质　　通过电击法将经过BglII单酶切线性化的表达粒的阳性转化子分别对应划线于MD和G418浓度酸性植酸酶16种质粒分别转化毕赤酵母。由于受为0.5μg/LMD平板上进行单拷贝的筛选。得到含-体酵母为His缺陷型(His),在不加His的基本培G418MD平板上不生长,MD平板上正常生长的克养基上不生长,只有整合得到的重组酵母才能正常隆,各取10个接种到BMGY液体培养基试管中,30℃培养至A值为3.0,离心洗去培养基,加入诱导培养基BMMY培养36h,取上清液进行SDS2PAGE电泳和表达产物酶活性的测定。结果显示pPCI9K和XHT1～15各组合内菌株的植酸酶最高与最低表达量在5%以内,各重组质粒内样品蛋白质表达量无差异,说明筛选到的转化子在质粒拷贝数和表达量方面是均一的。各构建分别取一菌株进行摇瓶实验,以得到更加准确可靠的结果。2.4　毕赤酵母中高效表达的分析16个表达菌株经过摇瓶的培养和诱导后,上清液经EndoH进行脱糖基化处理后,进行SDS2PAGE电泳,考马斯亮蓝染色。表达的植酸酶分子量大小约为64kD,这证明植酸酶基因能有效分泌表达(图4)。定量扫描结果显示,pPCI9K的表达量为15mg/L,植酸酶酶活力为2.2u/mL。信号肽调Fig.3Constructionofplasmidsofinclusionelevenkindsofsignalpeptide整后构建质粒XHT1、XHT2、XHT3、XHT4、XHT5、©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net 158ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICAVol.35,No.2Table3ThecomparisonoftheexpressionvalueamongthoseplasmidsExpressionRelativityPhytaseactivitySampleLanelevel(mg/L)(%)(u/mL)name1151002.2pPCI9K2291934.5XHT13312064.7XHT24281864.3XHT357046512.0XHT46402656.4XHT579060013.5XHT68604009.5XHT796543310.5XHT810583859.2XHT911553659.0XHT10126241310.0XHT1113352335.2XHT1214382535.5XHT13Fig.4SDS2PAGEanalysisofphytaseexpressioninPichia15513407.8XHT14pastoris1612080017.3XHT15M,proteinmolecularweightstandards(kD);0,purifiedphytase;1,ex20purifiedphytase(Sigma)pressionvectorpPCI9K;2-16,expressionvectorsXHT1-15.MmarkerXHT6、XHT7、XHT8、XHT9、XHT10、XHT11、AT的比重;转录和翻译的效率;分泌信号肽;内源XHT12、XHT13、XHT14和XHT15的表达量与植酸蛋白酶的活性;宿主菌的种类和状态、培养基、生酶酶活力均比pPCI9K高。其中消除了Aox1启动子长条件、发酵参数等等。上述所有的因数在设计最与信号肽间的序列,导致表达量提高了93%;信号优外源蛋白质表达条件时都应充分考虑。肽按照酵母偏爱合成,导致表达量提高了106%;在　　通过连续延伸PCR技术全合成了按照酵母偏信号肽的起始密码ATG后增加Aox1基因ATG后的爱密码设计的信号肽,并且对信号肽序列对表达的1～10个氨基酸(A、I、P、E、E、F、D、I、L和V),影响进行了详尽的研究。在带5′2UTR的信号肽序以增加1个和3个氨基酸提高表达量最为明显,分列MF4I的设计中还设计使ATG附近不形成二级结别提高了3倍和5倍。另外在MF4I信号肽的引导构,且使mRNA的自由能尽可能大,以有利于提高序列和内切蛋白酶间增加EEAEAEAEPK10mRNA的翻译效率。在信号肽的起始密码子ATG后个氨基酸,使得表达量提高了2.4倍。优优组合的分别加入毕赤酵母Aox1基因ATG后的10个氨基构建XHT15,酸性植酸酶的表达量得以进一步的提酸,在MF4I信号肽的中间增加了EEAEAEAEPK10高,表达量达到了120mg/L,植酸酶酶活达到17.3个氨基酸,这大幅度地提高了外源基因的分泌表u/mL,表达量与酶活力分别是pPCI9K载体的8.00达。在毕赤酵母中,表达单元的染色体整合拷贝数倍和7.85倍。酶活力测定的结果与蛋白质表达量一般是单拷贝最优表达,拷贝数并不明显影响外源的结果一致(表3)。蛋白质的表达量[5],拷贝数大于10,对表达的影响[23]较大,对于植酸酶表达,较低拷贝数时影响很[21]3　讨论(Discussion)小。本文通过G418的抗性筛选将拷贝数控制在　　用毕赤酵母基因表达系统生产蛋白质很有发展单拷贝的水平,大大减小了拷贝数对研究的影响。前景。已有多种蛋白质表达量超过10克的高效表　　原始的酸性植酸酶基因在酵母中表达量较低,达例子,但是仍有很多蛋白质表达量很低。外源蛋为了使其能够适应大生产的需要,必须提高酸性植白质表达量仍不理想,真正推向市场的高表达产品酸酶的表达量。我们利用连续延伸PCR方法合成酵并不多。影响外源蛋白质在毕赤酵母中表达的因素母偏爱密码的酸性植酸酶基因,构建入优化的高表很多:表达单元的拷贝数;表达单元的酵母染色体达载体,表达量提高显著,经过高密度发酵后,重整合位点和方式;mRNA5′端和3′端非翻译区(5′2组酵母植酸酶的表达量达到了4.8g/L。另外,该载UTR和3′2UTR);转录起始位点ATG前后的序列;体系统在牛碱性成纤维生长因子基因、鱼生长激素©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net Feb.,2003熊爱生等:信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响159基因、cryIA(c)Bt基因的分泌表达中,都获得了较pressionofartificialsyntheticgeneofAspergillusnigerNRR3135phytase高的分泌表达量,比未优化载体提高了6～10倍inPichiapastoris.ChineseJBiotechnol,2001,17(3):254-258(引自:生物工程学报)(结果将另文发表)。12YaoQH,HuangXM,PengRH,FanHQ.Synthesisandsequencede2terminationofACCdeaminasegeneusingsuccessiveexpressiveextensionReferencesPCRmethod.ActaAgriculturalShanghai,1999,15(supplement):111ClareJJ,RaymentFB,BallantineSP,SreekrishnaK,RomanosMA.-16High2levelexpressionoftetanustoxinfragmentCinPichiapastoris(引自:上海农业学报)strainscontainingmultipletandemintegrationsofthegene.Biotechnolo213PengRH,XiongAS,LiX,FanHQ,HuangXM,YaoQH.PCR2aid2gy,1991,9(5):455-460edsynthesisandstableexpressioninE.coliofthecryIA(c)Btgene.2SreekrishnaK,NellesL,PotenzR,CruzeJ,MazzaferroP,FishW,ActaBiochimBiophysSin,2001,33(2):219-224FukeMetal.High2levelexpression,purification,andcharacterization(引自:生物化学与生物物理学报)ofrecombinanthumantumornecrosisfactorsynthesizedinthemethy214RomanosMA.PichiapastorisDNAforpPIC9expressionvector.1984,lotrophicyeastPichiapastoris.Biochemistry,1989,28(9):4117-GenBank,Z46233412515KoutzP,DavisGR,StillmanC,BarringerK,CreggJ,ThillG.Struc23WangYR,RenHW,AnL,FangM,LiLY,RuBG.ExpressionofturalcomparisonofthePichiapastorisalcoholoxidasegenes.Yeast,humantrefoilfactor3inPichiapastorisanditsbiologicalactivityanaly21989,5(3):167-177sis.ActaBiochimBiophysSin,2001,33(6):653—65816ZhaoX,HuoKK,LiYY.SynonymouscodonusageinPichiapastoris.(引自:生物化学与生物物理学报)ChineseJBiotechnol,2000,16(3):308-3114WangTY,WangCM,WeiG,QiouJW,HuangYS.Expressionofthe(引自:生物工程学报)recombinanthumaninterleukin211inPichiapastoris.ActaBiochimBio217SambrookJ,FrischEF,ManiatisT.MolecularCloning:ALaboratoryphysSin,2001,33(6):659-664Manual,2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,(引自:生物化学与生物物理学报)1989,1-215SreekrishnaK,BrankampRG,KroppKE,BlankenshipDT,TsayJT,18QuanhongY,AishengX,RiheP.ChemicalsynthesisofacidphytaseSmithPL,WierschkeJDetal.Strategiesforoptimalsynthesisandse2gene.2002,GenBank,AF542235cretionofheterologousproteinsinthemethylotrophicyeastPichiapas219ScorerCA,ClareJJ,McCombieWR,RomanosMA,SreekrishnaK.toris.Gene,1997,190(1):55-62RapidselectionusingG418ofhighcopynumbertrasformantsofPichia6HollenbergCP,GellissenG.Productionofrecombinantproteinsbypastorisforhigh2levelforeigngeneexpression.Bio/Technology,1994,methylotrophicyeasts.CurrOpinBiotechnol,1997,8(5):554-56012:181-1847EckartMR,BussineauCM.Qualityandauthenticityofheterologous20YaoB,ZhangCY,WangJH,FanYL.Overexpressionofphytaseac2proteinssynthesizedinyeast.CurrOpinBiotechnol,1996,7(5):525tivitygeneinPichiapastoris.SciinChinaSerC,1998,28(3):237-530-2438SudberyPE.Theexpressionofrecombinantproteinsinyeasts.Curr(引自:中国科学C辑)OpinBiotechnol,1996,7(5):517-52421HanY,WilsonDB,LeiXG.ExpressionofanAspergillusnigerphytase9SouthgateVJ,SteynAJ,PretoriusIS,VanVuurenHJ.Expressionandgene(phyA)inSaccharomycescerevisiae.ApplEnvironMicrobiol,secretionofBacillusamyloliquefaciensalpha2amylasebyusingtheyeast1999,65(5):1915-1918pheromonealpha2factorpromoterandleadersequenceinSaccharomyces22vanderHeeftFC.Phytaseactivity,vanadatemanualmethod.Gist2bro2cerevisiae.ApplEnvironMicrobiol,1993,59(4):1253-1258cadesMethodNr,1995,61696-4I,2832.0010KjeldsenT,PetterssonAF,HachM.Secretoryexpressionand23ClareJJ,RomanosMA,RaymentFB,RowedderJE,SmithMA,PaynecharacterizationofinsulininPichiapastoris.BiotechnolApplBiochem,MM,SreekrishnaKetal.Productionofmouseeppidermalgrowthfactor1999,29(1):79-86inyeast:High2levelsecretionusingPichiapastorisstrainscontaining11BeiJL,ChenZ,YangL,LiaoL,WangXZ,JiangZY.Overex2multiplegenecopies.Gene,1991,105:205-212©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net 160ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICAVol.35,No.2InfluenceofSignalPeptideSequencesontheExpressionofHeterogeneousProteinsinPichiapastorisXIONGAi2Sheng,PENGRi2He,LIXian,FANHui2Qin,YAOQuan2Hong3GUOMei2Jin1,ZHANGSi2Liang1(Agro2BiotechnologyResearchCenterofShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,ShanghaiKeyLaboratoryofAgriculturalGeneticsandBreeding,Shanghai201106,China;1Bio2engineeringDepartmentofEastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China)AbstractPichiapastorishasbeendevelopedtobeaveryefficientexpressionhostfortheheterogeneousproteinssinceitsalcoholpromoterwasisolatedandcloned,anditstransformationtechniquewasestablished.Forfurtherimprov2ingthesecretionexpressionofheterogeneousproteins,inthisresearch,thesignalsequenceswerestudied.Atfirst,theSaccharomycescerevisiaematingfactorαprepro2leadersequencewassynthesizedusingsuccessivePCRanddesignatedasMF4I.Then,tendifferentsignalsequenceswereconstructedbyaddingtheN2terminalresiduesofPichiapastorisAox1proteintotheN2terminaloftheMF4I.ThesetensignalsequenceswereusedfordirectingphytasegenesecretioninPichiapastoris,thesecretionofphytasewereincreasedinPichiapastorisstrainscontainingnewsignalsequence.Amongthesestrains,thephytasesecretionwashighestinstraincontainsignalsequenceaddedwithA,I,PthreeAox1N2termi2nalresidues;thephytasesecretionofPichiapastoriswas90mg/Linflake.Thesecretionwassix2foldthanthatwitho2riginalSaccharomycescerevisiaematingfactorαprepro2leadersequence.Inaddition,insertoftenresiduesEEAEAEAEPKcanfurtherincreasethephytasesecretionby35%,thesecretionreach120mg/L.KeywordsPichiapastoris;syntheticsignalsequence;expressionvector;highexpression;Received:August21,2002Accepted:October16,2002ThisworkwassupportedbygrantsfromScienceandTechnologyCommissionFoundationofShanghaiCityandShanghaiYongYeBio2engineeringCo.Ldt3Correspondingauthor:Tel,8622126220866023207;Fax,86221262209988;e2mail,yaoquanhong@yahoo.com©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net