影响毕赤酵母表达系统的因素.doc

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1、影响毕赤酵母表达系统的因素烟雨莫问摘要:巴斯德毕赤酵母(Pichiapatoris)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成包涵体、背景蛋白多、表达量不很高等缺陷；弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂，表达水平低，生产造价昂贵的不足，还具有其它酵母表达系统无法比拟的优越之处。但是酵母为高好氧微生物，在发酵过程中常常会出现供氧不足而限制了细胞密度的情况。关键词:毕赤酵母分泌表达微生物载体构建表达系统一、重组蛋白表达系统比较随着基因工程技术的发展，大量重组蛋白得到了有效

2、地外源表达。目前主要的重组蛋白表达系统有:大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等表达体系[1]。相比之下(表1)，各种表达系统各有优缺点:表1各种表达体系特征比较表达体系优缺点产量原核体系大肠杆菌具有良好的可操作性,成本低,但不能进行糖基化修饰,胞内形成包涵体外源蛋白10%～70%胞内表达,0.3%～4%胞外表达真核体系酵母兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力,但存在产量低及过度糖基化等问题外源蛋白约占菌体总蛋白的10%甲醇营养型酵母第二代酵母表达系统,部分克服了过度糖基化缺点,有较好分泌性,产量较高,但产物结构与天然分子仍有一些差异。外源蛋

3、白占菌体总蛋白的10～30%昆虫细胞具有高等真核生物表达系统的优点,产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似,表达水平较高,但糖基化程度较低,形式单一。外源蛋白占菌体总蛋白的1～500mg/L哺乳动物细胞系统产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近,糖基化等后加工最准确,但表达水平较低。发酵液中表达产物含量为0.2～200mg/L使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低；但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低[2]。酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平

4、高，成本低，但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同。哺乳动物表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态，但表达量低，操作繁琐，而且成本非常昂贵[3]。由于不同的表达系统在表达量、蛋白表达周期、蛋白折叠和加工能力、蛋白翻译后修饰如糖基化修饰和经济成本等方面存在差异，因此需要根据不同的重组蛋白特点以及不同应用目的来选择合适的表达系统。二、酵母表达系统2.1毕赤酵母表达系统概述现在已经建立和发展了多种酵母表达菌株，这些酵母各有特点，自1981年Hitzeman等用成功地表达了人干扰素以来，S.c表达了大量的外源蛋白，目前仍在在制药业中广泛应用。但具有一定的局限性，如

5、难于高密度培养，缺乏强有力的启动子，分泌效率低，很难分泌分子量大于30kDa的外源蛋白质，而且富含甘露糖型的超高糖基化，表达蛋白质的C末端经常被截短[3]。人们在研究过程中发现一种更好的表达系统——毕赤酵母表达系统，目前该表达系统被广泛应用，此系统不仅具有高稳定、高表达、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母一巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)具有高密度生长的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作为单一C源的酵母，主要有H.Polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三种。其中P.Pastoris作为基因表达系统使用得最多、

6、最广泛，己被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越收到人们的重视。毕赤酵母表达系统已基本成为非常完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子A0X1，已高效表达了多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模。2009年来自该系统的KALBITOR已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的。毕赤酵母表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要作用，促进更多外源

7、基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品。2.2毕赤酵母的优势毕赤酵母系统的成功应用，缘于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点:(1)含有AOX启动子，这是目前启动能力最强，调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；(2)表达量高，既可以胞内表达，又可以分泌表达。绝大多数外源基因比在原核细胞、酿酒酵母、真核细胞中表达量高。一般毕赤酵母中外源基因都带有分泌信号肽，使外源目的蛋白分泌到培养液中，方便纯化；(3)发酵工艺成熟，适合高密度发酵。己经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达150g/L以上[10

8、]，表达重组蛋白时，已成功放大到80，000升；(4)使用基础盐培