毕赤酵母表达知识

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1、很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTINstocksolution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。b.有几个比较迷惑的问题请教

2、大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10)分装到1.5mlEP管中。说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。LithiumacetatedoesnotworkwithPichiapastoris.Useonlylithiumchloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱

3、布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。invitrogen手册上可以灭菌的。glucose和含氮化合物在一起容易

4、产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTINstocksolution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的

5、生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10)分装到1.5mlEP管中。说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。LithiumacetatedoesnotworkwithPichiapastoris.Useonlylithiumchloride.3、YNB到底能高温灭么

6、？有的说能有的说不能。过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。in

7、vitrogen手册上可以灭菌的。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。想请教下关于菌种保存的方法。我现在是采用斜面保存的方法，但感觉每次接菌都要打开斜面，而且每次的接菌量难免会有不少的误差，所以很想问一下大家都是怎么保存菌种的，特别是甘油菌的保存方法。我一般吸取300ul的菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀．防于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱一般OD是2-6，过夜菌在筛选高表达菌种中，我一般有一下步骤，很很多人做的不太一样，和说明书也有点差异，如下：每次转化前，均用多种酶切，B

8、lgII/salI/sa