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1、-毕赤酵母高效表达策略概述1.基因的内在特性主要包括mRNA5’端非翻译区(5’2UTR)、基因的A+T组成和密码子的使用频率3个方面。由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30%以上)因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA5’－UTR。尽可能和AOXlmRNA5’－UTR相似是必需的,最好是保持两者一致。A+T含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为AT丰富区可能存在转录提前终止信号。因此对AT含量丰富的基因最好是重新设计序列,使其A+T含量在30%～55%范围内
2、。巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。（赵翔,霍克克,李育阳.毕赤酵母的密码子用法分析[J].生物工程学报,2000,16(3):308-311.）外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。2．选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI启动子。PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β-LabZ基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同
3、时其产量更高,所以成为代替PAOX1最有潜力的启动子。通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体,从AOX1基因缺陷菌株中分离Mut+的自发突变体，从中筛选提高表达量的突变体。（戴秀玉,王恂,周坚1毕赤氏酵母PAOX2突变化序列分析〔J〕1微生物学报,1999,39(6):559～5611）3．增加外源基因整合拷贝数（1）Invitrogen公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子（配合电激法转化的效果更好）。（2）在体外载体上多次插入目的基因片段。（3）将
4、载体中目的基因两端连上来自宿主或其它非必需高重复的基因片段,通过同源重组而达到高拷贝整合的目的。（聂东宋,梁宋平,李敏1外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略〔J〕1吉首大学学报(自然科学版),2001,22(3):40～41）4．载体和宿主的选择KM71转化子是muts表型,而GS115转化子主要是mut+表型,也有一小部分是muts表型。哪一种表型对外源蛋白的表达量更高,对每一种蛋白而言是不确定的。信号肽也是影响分泌表达水平的很重要因素。α-交配因子和目的基因之间插入一个间隔肽(spacerpeptide)可以提高外源
5、蛋白的表达水平。（王燕,梁镇和,张友尚,等.人胰岛素在甲醇酵母Pichiapastoris中的分泌表达[J].生物化学与生物物理学报,1999:31(5):587-589.）5．优化发酵条件发酵条件主要包括通气量、温度、pH、甲醇含量和培养时间等。5．1通气量是影响表达水平的极为重要的因素。用发酵罐进行培养,外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶发酵高出10～100倍.主要原因是普通摇瓶发酵的通气不理想,影响了菌体的高密度生长及表达。许多文献报道的表达水平都是摇瓶发酵条件下的结果,可以推测,如果用发酵罐进行培养,表达水平还会有上升
6、的空间。5．2碳源也是影响高水平表达的重要因素。毕赤酵母表达培养基常用的碳源是甘油,但甘油对AOX启动子有抑制作用。山梨糖醇代替甘油作为碳源,结果生物质量下降,但外源蛋白的表达有所提高5．3培养基组成目前主要有BMGY、FBS2种培养基可用于培养P.pastoris。但由于BMGY既含有磷酸缓冲液又含蛋白胨和酵母提取物,因而菌株生长更好,大大增加了生物量,使表达量也相应大大提高。5．4甲醇诱导的方式、用量、诱导时间诱导的方式：两步法(先用甘油培养使细胞达到一定的浓度,再加甲醇诱导)和联合生长培养的方法(growth-ass
7、ociated,在早期加入甲醇诱导)来诱导外源蛋白的表达都有成功的报道。现在一般两步法来诱导外源蛋白的表达。用两步法来诱导外源蛋白的表达,则诱导时的起始pH可能是毕赤酵母高效表达重组蛋白的关键之一,通过改变诱导时的pH值,可使表达量提高50%以上。（邱荣德,朱建蓓,王垒,等.人p53蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达[J].生物工程学报,1999,15(4):477-481.）growth-associated是诱导甲醇酵母高水平表达外源基因的很好方法,比普通方法高出10倍（OhashiR,MochizukiE,SuzukiT.
8、Amini-scalemassproductionandseparationsystemforsecretoryheterologousproteinsbyperfusioncultureofrecombinantPichiapastorisusingashakenceramicmembraneflas
