《猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号S852.65密级：论文编号：2011021529贵州大学2015届硕士研究生学位论文猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病病原分子生物学导师：汤德元教授研究生：王洪光中国﹒贵州﹒贵阳2015年6月 贵州省自然科技基金资助项目猪呼吸道病毒性疫病新型特异诊断技术多重PCR检测的研究黔科合J（2013）2110号 贵州大学2015届硕士研究生学位论文目录中文摘要.....................................................................................................................ⅠAbstract.......................................................................................................................Ⅲ第一章文献综述.........................................................................................................11六种猪呼吸道病毒性疫病概述............................................................................................11.1猪伪狂犬病.................................................................................................................21.2猪圆环病毒病.............................................................................................................41.3猪繁殖与呼吸道综合症.............................................................................................71.4猪瘟...........................................................................................................................101.5猪细小病毒病...........................................................................................................131.6猪流感.......................................................................................................................162病毒检测技术的研究进展..................................................................................................202.1病毒分离...................................................................................................................212.2血清中和试验...........................................................................................................212.3荧光抗体染色法.......................................................................................................212.4ELISA检测..............................................................................................................212.5聚合酶链式反应.......................................................................................................222.6核酸探针杂交试验...................................................................................................233PCR诊断方法的研究进展与应用....................................................................................244研究的目的和意义.............................................................................................................25第二章PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV的PCR/RT-PCR方法的建立..................................................................................................................................261材料.....................................................................................................................................261.1病毒..........................................................................................................................261.2临床病料..................................................................................................................261.3主要试剂..................................................................................................................261.4主要溶液的配制......................................................................................................271.5主要实验仪器..........................................................................................................272方法.....................................................................................................................................282.1引物设计与合成......................................................................................................282.2病料核酸的提取......................................................................................................282.3病毒核酸的PCR/RT-PCR扩增............................................................................282.4PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV目的基因的鉴定.........................292.5单项PCR/RT-PCR诊断方法的建立.....................................................................303结果.....................................................................................................................................313.1单项PCR/RT-PCR诊断方法的建立.....................................................................314讨论.....................................................................................................................................375结论.....................................................................................................................................37第三章PRV、PCV2、PPV三重PCR及PRRSV、CSFV、SIV三重RT-PCR方法的建立与初步应用.............................................................................................381材料.....................................................................................................................................38 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究1.1病毒..........................................................................................................................381.2临床病料..................................................................................................................381.3主要试剂..................................................................................................................381.4主要实验仪器..........................................................................................................392方法.....................................................................................................................................392.1引物设计与合成......................................................................................................392.2病料核酸的提取......................................................................................................392.3病毒核酸的PCR/RT-PCR扩增............................................................................392.4PRV、PCV2、PPV三重PCR方法的建立..........................................................402.5PRRSV、CSFV、SIV三重RT-PCR方法的建立...............................................403结果.....................................................................................................................................413.1三重PCR诊断方法的建立....................................................................................413.2三重RT-PCR诊断方法的建立..............................................................................434讨论.....................................................................................................................................455结论.....................................................................................................................................45第四章多重PCR方法的建立与初步应用...............................................................471材料.....................................................................................................................................471.1病毒..........................................................................................................................471.2临床病料..................................................................................................................471.3主要试剂..................................................................................................................471.4主要实验仪器..........................................................................................................472方法.....................................................................................................................................472.1引物设计与合成.......................................................................................................472.2病料核酸的提取.......................................................................................................472.3四重PCR诊断方法的建立...................................................................................482.4五重PCR诊断方法的建立...................................................................................482.5六重PCR诊断方法的建立...................................................................................493结果.....................................................................................................................................503.1四重PCR诊断方法的建立....................................................................................503.2五重PCR诊断方法的建立....................................................................................523.3六重PCR诊断方法的建立....................................................................................543.4六重PCR试剂盒的组装........................................................................................574讨论.....................................................................................................................................585结论.....................................................................................................................................59主要参考文献：.........................................................................................................60附录一攻读硕士学位期间参与发表的论文.........................................................69附录二本文用到的部分英文缩写及含义说明.......................................................71致谢..........................................................................................................................71创性声明................................................................................................................71关于学位论文使用授权的声明..................................................................................71 贵州大学2015届硕士研究生学位论文猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究中文摘要猪呼吸道疾病是影响养猪业发展的主要疾病之一，是目前我国规模化猪场的常发病、多发病，已经引起人们的普遍重视，给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪流感病毒是最为多见的猪病毒性呼吸道疾病病原，且在临床上常呈混合或继发感染。猪群中，多病原混合感染已是疾病发生的普遍特点，两种或以上病原体共同感染导致猪群发病率和死亡率增高，使得疾病诊断和防治难度加大。为实现临床多病原混合感染的快速确诊，本研究建立了针对上述6种病毒的多重PCR鉴别诊断方法，为相关疫病的快速诊断和防控提供了有效的技术手段。主要研究内容如下：1、PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV的单项PCR/RT-PCR方法的建立参照NCBI中PRVgB（AF257079）、PCV2ORF2（NC_005148）、PRRSVORF6（NC_001961）、CSFVC（AY805221）、PPVNS1（NC_001718）、SIVM（GU086140）等基因序列，应用相关软件各设计了1对特异性引物，分别用于扩增PRVgB基因、PCV2ORF2基因、PRRSVORF6基因、CSFVC基因、PPVNS1基因和SIVM基因的部分序列，扩增的目的片段大小分别为192bp、255bp、364bp、530bp、759bp和981bp，通过对目的基因的测序鉴定以及反应的条件优化，建立了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV的单项PCR/RT-PCR方法，为摸索建立多重PCR方法的条件打下基础。2、三重PCR及三重RT-PCR鉴别诊断方法的建立与初步应用在建立的PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的单项PCR/RT-PCR方法的基础上，以阳性病毒核酸为模板进行多重PCR扩增及反应体系和反应条件的优化，分别得到与设计相符合的3条特异性条带，建立了能同时检测PRV、PCV2和PPV三种DNA病毒的三重PCR方法和能同时检测PRRSV、CSFV和I 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究SIV三种RNA病毒的三重RT-PCR方法。试验结果表明该方法具有较好的敏感性和特异性，且均在56℃时检测效果最好。该方法对临床病料的检测结果与单项PCR结果一致。3、猪呼吸道病毒性疫病多重PCR鉴别诊断方法的建立与初步应用在建立的三重PCR方法及三重RT-PCR方法的基础上，通过对多重PCR反应条件的优化，以及临床应用检测，成功建立了能同时检测PRV、PCV2、CSFV和SIV四种病毒的多重PCR方法，能同时检测PRV、PCV2、PRRSV、CSFV和SIV五种病毒的多重PCR方法，以及同时检测PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV六种病毒的多重PCR方法，敏感性试验表明，建立的多重PCR最低检测限均达到pg级水平，特异性结果表明均只能检测出目的条带，对其他病毒扩增结果呈阴性。该方法对48份临床病料的检测结果表明其能快速、准确地对病料进行检测。关键词：猪呼吸道；病毒性疫病；多重PCR；混合感染；临床检测II 贵州大学2015届硕士研究生学位论文EstablishmentandApplicationofamPCRMethodforSimultaneousDetectionofPorcineRespiratoryandViralDiseasesAbstractWiththedevelopmentoflarge-scaleandintensivepigindustry,pathogenmixedinfectionandsecondaryinfectionofpigdiseasesarebecomingmoreandmorecommon.RespiratorydiseaseasoneofthemajordiseasesisoftenoccurredinrecentyearsinscalepigfarmsofChina,causinggreatlossestoourcountry.Pseudorabiesvirus,porcinecricovirus,reproductiveandrespiratorysyndromevirus,swinefevervirus,porcineparvovirus,andswinefluvirusarethemostcommonviralpathogensofpigrespiratorydiseases,andoftenshowmixedorsecondaryinfectioninclinical.Infectioncausedbymultiplepathogensinpigsisbecomingmoreandmorepoplarnowadays,andthatcausedbytwoormorepathogensisleadingtohighmorbidityandmortalityandmakingmoredifficultinthediagnosisandtreatmentofdiseases.mPCRdifferentialdiagnosismethodsforthesepathogensareestablishedtorapiddetectmixedinfectioninclinical,andprovidesaneffectivetechnicalmeansforrapiddiagnosisandpreventionandcontrolforrelateddiseases.Themainresearchcontentsareasfollows:1、EstablishmentoftheSinglePCR/RT-PCRmethodofPRV,PPV,PCV2,PRRSV,CSFVandSIVAccordingtothegenesequencespublishedinGenbankofPRVgB（AF257079）,PCV2ORF2（NC_005148）,PRRSVORF6（NC_001961）,CSFVC（AY805221）,PPVNS1（NC_001718）andSIVM（GU086140）,sixpairsprimersweredesignedandsynthesizedtoamplifypartfragmentsofthespecificgenesofPRVgB,PCV2ORF2,PRRSVORF6,CSFVC,PPVNS1andSIVMrespectivelyandthecorrespondingamplifiedfragmentsare192bp,255bp,364bp,530bp,759bpand981bp,successively.ThensinglePCR/RT-PCRmethodofPRV,PPV,PCV2,PRRSV,III 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究CSFV,PPVandSIVwereestablishedbyoptimizingthereactionconditionstolayfoundationfortheestablishmentofmultiplexPCR.2、EstablishmentandPreliminaryApplicationofthe3-plexPCRand3-plexRT-PCRmethodOnthebasisoftheestablishedsinglePCRmethodofPRV,PCV2,PRRSV,CSFV,PPVandSIV,the3-plexPCRand3-plexRT-PCRreactionconditionwasoptimizedandthemultiplexPCRandRT-PCRmethodwreeestablished.Theresultsshowedgreatsensitivityandspecificityandthedetectionresultwerebothbestat56℃.ThepreliminaryapplicationtestshowedthedetectionresultsofclinicalsampleswereconsistentwiththatofsinglePCRandRT-PCR.3、EstablishmentandPreliminaryApplicationofthe4-plexPCRmethod,5-plexPCRmethodand6-plexPCRmethodOnthebasisoftheestablished3-plexPCRand3-plexRT-PCRmethod,the4-plexPCRmethod,5-plexPCRmethodand6-plexPCRmethodreactionconditionwasoptimizedandthethreemultiplePCRmethodswereestablished.TheresultsshowedthemultiplePCRassayscandetectonlytheaimvirus,andthedetectionviralnucleicacidlevelispg.Theresultsofpreliminaryapplicationfor48clinicalsamplesshowedtheestablishedmultiplePCRassayshaswideprospects.Keywords:respiratorydisease;viraldisease;multiplexPCR;mixedinfection;clinicaltestingIV 贵州大学2015届硕士研究生学位论文第一章文献综述现代养猪业已经逐步朝着规模化和集约化发展，但随着规模化和集约化程度的越来越高，猪群多病原引发的混合感染和继发感染情况也越来越普遍，猪病的复杂程度及其危害也与日俱增，猪传染病混合感染和继发感染的发生和流行成为制约养猪生产的重要因素（Ogawaetal，2009）。近年来，多病原混合感染，繁殖障碍性传染病和呼吸道传染病的普遍存在是我国猪传染病流行的主要特征，特别是猪病毒性呼吸道疫病是目前我国规模化猪场的常发病和多发病，由于该病是由多因素多病原引起，表现的临床症状及病理变化有很大相似度，导致猪场在疾病诊断和防治措施上难度加大，给我国养猪业带来极大的经济损失。猪呼吸道疫病是由多种因素共同作用引起的，病毒、细菌、支原体、寄生虫、不良的饲养管理条件及低抵抗力猪群等是其主要常见病因（张家恭，2008）。猪呼吸道疫病的病原主要包括原发性病原与继发性病原。猪伪狂犬病毒(Porcinepseudorabiesvirus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcinecircoviruses,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)、猪流感病毒(SwineInfluenzaVirus,SIV)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)等是主要的原发性病原；而猪细小病毒+(Porcineparvovirus,PPV)、猪链球菌(SS)、产毒素多杀性巴氏杆菌(TPM)、支气管败血波氏杆菌(Bb)、副猪嗜血杆菌(HP)、猪附红细胞体(EPerythrozoonsuis/E-suis)等是主要的继发性病原（陈微晶，2008）。PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV与SIV6种病毒在猪场常发生的各类呼吸系统疾病中较为多见，是主要的呼吸道病毒性疫病病原，同时也都可以导致猪群出现繁殖障碍；PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV均可以不同程度地损伤机体免疫系统，降低机体对外界的抵抗能力，引起继发性混合感染，导致疫病复杂化，病症加重（Laila，etal2012；Merijn，etal2011；Suresh，etal2010；Immanuel，etal2013；谢金文等，2011）。断奶前后的仔猪和早期育肥猪是猪呼吸道疫病侵害的主要宿主，此阶段猪群的猪母源抗体保护力开始下降，自身免疫功能又没有建立完全，消化和呼吸系统功能尚未健全，同时由于断奶、混群和饲料更替等应激，使得猪只极易发生呼吸道疫病（Salichs，etal2013；Ticó，etal2013）。猪群发生呼吸道疫病时主要表现为发热、咳嗽、气喘、呼吸困难、眼鼻分泌物增多、食欲减退、迅速消瘦等1 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究症状；剖检常可见呼吸器官不同类型和不同程度的病变，但主要表现为肺脏病变，如肺肿胀、淤血、水肿，肺间质增宽，肺炎、间质性肺炎，肺组织肉变和肝变、肺出血、坏死、肺局灶性硬结或脓肿、纤维化(橡皮肺)等（刘翠权，2011）。以上六种病毒感染后临床症状较为相似，给猪呼吸道性与繁殖障碍性疾病的诊断带来了一定的困难。1.六种猪呼吸道病毒性疫病概述1.1猪伪狂犬病猪伪狂犬病最早见于美国，是由猪伪狂犬病病毒引起的一种高度接触性传染病，又称奥叶基氏病（Aujeszky‘sdisease,AD），由匈牙利学者AladarAujeszky（1902）首次作了报告，并由Traud在1933年通过组织培养方法成功分离到了病原（金冬日等，2012）。我国刘永纯1947年首次报道猪伪狂犬病，其后周圣文于1956年初次在我国宝泉岭农场仔猪中分离到该病毒（杨庆芳等，2010）。目前该病已在世界上50多个国家和地区发生过，同时己被1999年版国际动物卫生法典列为B类传染病，我国农业部也在1999年发布了第96号公告，将该病列为第一个二类动物疫病。猪是该病的主要宿主和传染源，成年猪多表现隐性感染，但会长期带毒排毒，妊娠母猪常表现为繁殖障碍，多引起流产、死胎、弱胎、木乃伊胎；公猪可引起睾丸粘膜炎；仔猪感染后不仅出现神经症状，还可侵害消化系统，同时会出现打喷嚏，咳嗽、呼吸困难等症状，死亡率常高达100%；育肥猪多引起增重和发育障碍，给畜牧业尤其是集约化养殖业和毛皮动物生产造成了巨大的经济损失（李春华等，2008）。1.1.1PRV病原学特征猪伪狂犬病毒（PseudorabiesVirus,PRV）属于疱疹病毒科（Herpesviridae）α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinaesubfamily)猪疱疹病毒I型（SuidHerpesvirus1），暂定为水痘病毒属。完整病毒粒子呈椭圆形或圆形外观，核内无囊膜病毒粒子直径在110～150nm之间，成熟病毒粒子位于胞浆内，其直径约为150~180nm，缺少囊膜的裸露核衣壳也具有感染性，但其感染力明显降低。病毒粒子主要由20面体的核心和外层衣壳组成，核心的成分是核酸蛋白，由双链DNA分子和蛋白质缠绕而成，而外层衣壳由呈放射排列的互相连接的162个中空壳粒组成。病毒的囊膜表面还有长度在8～10nm之间呈放射状排列的纤突（张定姣等，2013）。2 贵州大学2015届硕士研究生学位论文PRV是具有较强抵抗力的疱疹病毒，在物体表面和液体中持续可存活7d，在低温潮湿、pH6～8环境中能够长期保持稳定，且活力不会明显降低；但PRV在4～37℃温度之间、pH4.3～9.7范围的环境中，经过1～7d即可失去活性。在pH4～9的腐败环境下，病料中的病毒粒子经11d可失去感染力。PRV可抵抗较高温度，在55～60℃温度时需30～50min才可灭活，当在80温度下时3min即可失活，100℃时病毒能被瞬间杀死。PRV对紫外线、氯仿、乙醚等脂溶剂等也有较高的敏感性，胰蛋白酶和某些酶类也能使该病毒失活，常用的各种化学消毒剂也可杀灭该病毒（殷震等，1997）。1.1.2PRV基因组结构6PRV具有双链线性基因组DNA，其核苷酸长度约为150kb，分子量为87×10kD，PRV基因中G+C含量较一般病毒高出很多，最高含量可达73％，至少由70个基因组成，其中55个已被鉴定，可编码的蛋白质就高达70~100种，构成成熟病毒粒子的蛋白质就有50多种（赵蕾等，2011）。病毒基因组由四个部分组成，包括一个独特区长序列（Uniquelongregion,UL）、一个独特区短序列（Uniqueshortregion,US）、短序列独特区两侧的末端颠倒重复序列（Terminalrepeat,TR）和内部重复序列（Internalrepeat,IR），其中US区的方向与UL区的方向既可相同也可相反，所以伪狂犬病毒有两种异构体，但病毒的生物学特性并未因此受到影响（初小辉，2011）。1.1.3PRV编码蛋白目前已经发现的PRV结构蛋白就有11种，其中gG蛋白是外分泌蛋白，而其他10种均位于囊膜上，gB、gD、gH、gK和gL是PRV复制所必需的糖蛋白，其中gB蛋白是PRV最保守的糖蛋白之一，gD蛋白是一种重要的中和抗原，gH蛋白与病毒粒子侵入细胞和在细胞间直接传播相关，gK是不久前才被鉴定的一种糖蛋白；而gC、gE、gG、gI、gM、gN是非必需糖蛋白，非必需糖蛋白的缺失不会影响PRV的体外复制，其中gE蛋白决定着病毒的毒力和复制过程，gC蛋白是PRV主要的中和抗原，gG蛋白具有很强的抗原性，gI蛋白决定病毒从细胞中的释放过程，gM蛋白具有保守性，gN蛋白与参与病毒的穿入过程。PRV非结构蛋白直接影响着病毒毒力强弱，主要包括囊膜糖蛋白，多种酶及衣壳蛋白，分别参与介导病毒进入宿主并扩散，病毒编码、DNA代谢或磷酸化，以及病毒3 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究装配，同时胸苷激酶是PRV最主要的毒力基因（张定姣等，2013）。1.1.4PR流行病学当前猪伪狂犬病在世界上分布十分广泛，在欧洲、南美洲、中美洲、东南亚等50多个国家和地区均有发生，给这些地方的养殖业造成了极大危害，使得养殖的动物发病率和死亡率呈现不断上升的趋势。PR在我国流行范围也较广，目前发生过该病的省份已有20多个，多数呈散发性流行，大规模的暴发流行还未见报道（金冬日等，2012）。PRV具有较强的致病性，可感染多种动物，常见的有牛、羊、老鼠、猪、猫等，但易感程度不同。猪是该病毒的主要宿主，各种年龄猪均易感，其中以妊娠母猪和仔猪为最，断奶仔猪发病率为20～40％，死亡率为10～20％，15日龄以内的仔猪发病率和死亡率可高达100％；该病在养猪密集的省市发病率相对较高（孟潇等，2012）。猪场中感染PRV的病猪、死猪、愈后猪，受污染的粪尿、垫草等用具以及可携带和感染病毒的动物如老鼠等均可作为伪狂犬病的传染源而传播该病。PRV既可水平传播又可垂直传播，水平传播主要从呼吸道、消化道、直接接触感染等方面进行，垂直传播通过母体胎盘使仔猪先天感染。本病的发生无明显季节性，但以冬季和春季较多。PRV具有高度潜伏感染性，当机体内外环境变化（受到免疫抑制或应激而导致机体抵抗力降低）时，即可被激活，从而引起疾病暴发（闫亚景等，2006）。1.2猪圆环病毒病猪圆环病毒(PorcineCirocovirus,PCV)是人们发现的第一个与动物有关的圆环病毒，也是目前发现的最小动物病毒，是德国科学家Tischer等（1974）于1974年首次在猪肾细胞系PK15中发现的，当时认为是一种细胞污染物，后发现为无囊膜的二十面体的单链环状病毒，被命名为PCV-1，不具有致病性。其后Meehan等（1998）于1997在法国从断奶后多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)病猪中分离并提纯了到具有致病性的PCV-2，其与PCV-1抗原性存在差异（Meehan,etal.1998）。之后该病广泛流行于欧美许多国家和地区。目前猪群感染PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、怀孕母猪繁殖障碍(Reproductivefailure)、断奶猪和育肥猪呼吸道疾病综合征(Porcine4 贵州大学2015届硕士研究生学位论文RespiratoryDiseaseComplex,PRDS)、猪皮炎和肾炎综合征(PorcineDermatitis&NephropathySyndrome,PDNS)，仔猪先天性震颤或断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种疾病，但这些疾病并不是由PCV-2单一感染所致，而是一些其他诱因或病原体辅助并相互作用的结果（李中兴等，2013；胡思科等，2006）。1.2.1PCV病原学特征PCV属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），病毒粒子直径仅14-17nm，无囊膜，呈二十面体对称，是目前发现的一种最小的动物病毒，由衣壳蛋白(Capsidprotein，Cap蛋白)和核酸组成。Cap蛋白是1条多肤链，分子量为36kDa；核酸为一条共价闭合、环状的单股负链DNA，DNA长1760bp左右(PCV-1核酸全长1759bp，PCV-2核酸全长1768bp或1767bp)，分子量为0.58×106D（孙艳明等，2006）。PCV可用PK-15细胞进行培养增殖，增殖的PCV2常会形成包涵体，其中多数位于细胞浆，但也有少部分位于细胞核，包涵体大多呈圆形或卵圆形，PCV2不会使宿主PK-15细胞出现细胞病变（CPE），且需盲传多代才能有效增殖。PCV核酸DNA的复制依赖于细胞周期S期表达的细胞蛋白，故其适于在具有旺盛增殖能力、处于有丝分裂的细胞上增殖（张嗣华，2007）。PCV无血凝活性，不能够凝集猪、牛、羊、鸡等多种动物和人的红细胞（Tischeretal.，1995）。PCV对外界环境具有较强的抵抗力，在pH3的酸性环境及氯仿中可长期存活，高温环境（72℃）能存活15min，56℃时不能将其灭活（Tischeretal.，1982）。PCV2的细胞培养物可以耐受pH3的强酸以及70℃15min处理。PCV2对多种消毒剂均有较强的抵抗力，对乙醇、氯仿和碘酒等有机溶剂不敏感，在56℃或70℃氯仿处理一段时间，活性仍不丧失，室温条件下用乙醇、甲醛、碘酒等处理10min，病毒虽不至于失去活性但滴度会有所下降，季胺盐混合物、次氯酸钠、卫可、氢氧化钠及酚混合物也可使PCV2的感染滴度降低，其中卫可的作用效果最好（Royeretal，2001）。1.2.2PCV基因组结构PCV具有独特的单股负链环状基因组DNA，大小约为1.7kb。根据病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCV1和PCV2两个基因型（Brian，1998；Allan，1998）。PCV1不具有致病性，基因组全长为1759bp，包含7个开放性阅读5 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究框(ORFs)，其中最主要的是ORF1和ORF2；PCV2具有致病性，基因组全长为1767bp或1768bp，包含11个开放阅读框(ORFs)，其中ORF1和ORF2最为重要，由于PCV很小，基因组很短，使得这些ORFs都有一部分基因重叠在一起，以最大限度利用PCV为数不多的遗传物质以进行自身的复制（Nawagitguletal.，2000；谢俊岭，2013）。另外，ORF3基因与病毒诱导细胞凋亡有关，该基因的缺失可导致PCV2毒力下降。PCV的开放阅读框中ORF1序列比较保守，使得PCV1和PCV2能够产生抗原交叉反应；而ORF2编码的Cap蛋白是病毒主要的免疫蛋白，同时ORF2常可用来区分PCV1与PCV2（Nawagitgul,etal.2002）。PCV在宿主细胞内以滚环模式复制，而PCV在复制起始区都含有一个序列类似为5’-AAGTATTAC-3’的茎-环结构和一个发夹结构，而这种特殊结构就是病毒滚环复制的起点（娄忠子等，2010）。1.2.3PCV编码蛋白PCV的多个开放阅读框中最重要的是ORF1和ORF2，同时也是研究最深入和最大的2个开放阅读框。PCV1和PCV2的ORF1编码与病毒复制有关的Rep和Rep’蛋白，而Rep蛋白是PCV1和PCV2产生抗原交叉性的主要原因，在圆环病毒表达的所有蛋白中比较保守（来景辉等，2013）；ORF2编码构成病毒核衣壳的Cap蛋白，也是病毒唯一的结构蛋白，同时Cap蛋白是PCV的主要免疫原，PCV1与PCV2的Cap蛋白不存在交叉反应，没有抗原交叉性，相较于ORFl变异较大（Meehanetal.，1997;Mankertzetal.，1998;Truoungetal.，2001）。PCV2ORF3编码的蛋白与其致病性有一定关系，还可影响病毒Cap蛋白在机体内的免疫效果（Shen,etal.,2009）。1.2.4PCVD流行病学圆环病毒病已呈世界性流行，自1997年Clark(1997)首次报道加拿大发生了称为断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的疾病以来，由PCV2感染所致的疾病在世界各国各地的发生和流行也逐步上升，美国、法国、意大利、日本、韩国等许多国家和地区均有此病的发生和报道（王锡祯等，2008；CLARK，etal.1997）。在我国，猪群中也普遍存在PCV2感染，给我国的养猪业带来了严重的经济损失。猪是PCV2的天然宿主，各类型的猪不分品种、年龄、性别均可感染PCV2，6 贵州大学2015届硕士研究生学位论文但以哺断奶仔猪和育肥猪最易感，尤其是5～12周龄的仔猪，一般于断奶后2～3d就可以发病，但主要集中发生于断奶后2-3周，发病率和死亡率不稳定，但急性发生时，发病率可达60%，而病死率也可达25%以上（鲍伟华，2007）。PCV2常表现为隐形感染和持续性感染，当猪群受到温度、环境变化或应激等情况时，机体免疫力下降，病毒即可开始传播，从而导致疾病流行。病猪和带毒猪是主要传染源，该病主要通过呼吸道、消化道等途径进行水平传播；妊娠母猪感染PCV2后，可通过母体胎盘垂直传染给仔猪。本病的发生没有严格的季节性，一年四季皆可发生。1.3猪繁殖与呼吸道综合征猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproduetiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是一种新型高度传染性疫病，最早于1987年，在美国南部出现报道，随后传至加拿大，并迅速蔓延到世界许多国家和地区(Keffaberetal，1989)。荷兰中央兽医研究所于1991年首次用猪肺泡巨噬细胞(PAM)分离培养获得病原PRRSV，并定名为Lelysted病毒(LV)。我国郭宝清等(1996)首次在疑似PRRS的流产胎儿中分离出了该病毒，以此证实了我国存在PRRS。感染PRRSV后的猪群常出现免疫抑制以及肺中巨噬细胞数目减少等现象，以至于机体抵抗力降低从而导致呼吸系统病原菌的侵入，并诱发呼吸道症状(李华，1999)。本病发生时主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪呼吸症状和高死亡率，妊娠母猪主要发生流产、死产、产木乃伊胎及弱仔猪；种公猪主要表现为精液质量和精子活力受到影响；仔猪和育肥猪主要表现咳嗽、喷嚏、呼吸急促和呼吸困难等症状，病猪耳部和四肢等处皮肤发绀（钱如文，2009）。1.3.1PRRSV病原学特征PRRS的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorySyndromevirus,PRRSV)，该病毒属于新成立的尼多病毒目(orderNidovirales)动脉炎病毒科(familyArteriviridae)动脉炎病毒属(genusArterivirus)成员。该病毒与马动脉炎病毒(EAV)、小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(LDV)及猴出血热病毒（SHFV）等在生物学特性、结构和遗传性上具有相关性，但彼此间不存在血清学交叉反应。PRRSV粒子呈二十面体对称的多晶形或球形，具有囊膜，直径约为50～80nm。病毒核衣壳呈立体对称，具有电子致密性，核心直径为25～35nm，外层绕有双7 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究层脂质膜。PRRSV具有严格的宿主特异性，在猪肺泡巨噬细胞（PAM）生长效果最好，也可通过Mark-145细胞系进行增殖。通过Mark-145细胞系增殖的PRRSV对鹅、鸡以及哺乳动物的红细胞无血凝性，但小鼠红细胞有特异性血凝活性。根据基因组和抗原性的差异，PRRSV可分为两个主要基因型，即以LV为代表的欧洲型和以VR2332为代表的美洲型，两种病毒毒力有差异，欧洲型病毒毒力强，传播快，发病症状严重，死亡率高；美洲型病毒毒力弱，传播慢，发病较为缓和（吴国华等，2010）。近年来，美国又有学者认为，美国既有美洲型又有欧洲型，但临床表现接近欧洲型。我国郭宝清（1996）分离到的PRRSV为美洲型，但临床表现更接近于欧洲型。目前，我国的PRRSV流行株普遍属于美洲型。PRRSV对温度和pH敏感性较高，56℃经15～20min可完全散失活力，37℃可保持活力3h～24h，20℃可维持活力ld～6d，4℃经1周仅余10%感染性，低温下病毒感染性较稳定，-70℃时病毒感染滴度可维持数月不降低。PRRSV在pH6.5～7.5的环境中能稳定存在，当pH≤5或pH≥7时病毒感染性很快散失。PRRSV有脂质囊膜，对氯仿和乙醚等脂溶剂敏感，经其处理后，可丧失活性（白延杰，2009）。1.3.2PRRSV基因组结构PRRSV基因组为不分节段的单股正链RNA，全长约为15kb，具有5’端帽子和3’端Poly（A）尾巴结构，为动脉炎病毒属中最大的病毒。PRRSV含有9个开放阅读框（ORFs），ORFla、ORFlb、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7，以5’NCR-ORFla/lb-ORF2-GP3-GP4-GPS-M-N-NCR-3’NCR线性顺序排列，每个阅读框只编码一种特异性蛋白，且和相邻阅读框之间均有部分重叠，而编码M蛋白的ORF6基因保守性最强（Kangetal，2004）。其中ORF1是最大的阅读框，长约12kb，分为ORF1a和ORFlb，主要编码病毒的RNA复制酶和转录相关的酶。在其5’端和3’端分别有一非编码区，对于不同毒株大小不尽相同。在poly(A)尾的上游有一个高度保守的8核苷酸序列，被认为是结合用以启动负链RNA的合成的聚合酶区域（Mengetal，1994）。1.3.3PRRSV编码蛋白PRRSV含有9个ORFs，每个ORF只编码一种特异性蛋白，其中ORF1编码病毒的RNA聚合酶，产物为ORF1a和ORF1b编码的可通过自身水解过程分解为多个非结构蛋白(NSP)的多聚蛋白；ORF2～ORF7编码病毒的结构蛋白，其8 贵州大学2015届硕士研究生学位论文中ORF2～ORF5编码病毒的糖蛋白GP2～GP5，ORF6编码病毒的膜基质(M)蛋白，ORF7编码核衣壳(N)蛋白，该蛋白具有保守性，且ORF6与ORF7编码的蛋白为主要结构蛋白（单悦等，2012）。1.3.3.1PRRSV结构蛋白GP2（包括GP2a与GP2b）、GP3与GP4通过共价键形成异源三聚体与GP5、M、N蛋白共同组装成PRRSV颗粒，是构成病毒粒子的次要囊膜蛋白（Wissinketal，2004）；GP3决定PRRSV毒力，是病毒突变性最高的蛋白质之一，具有较强的免疫原性；GP4可诱导机体产生中和抗体，参与病毒中和反应，同时影响免疫导向性；GP5又叫E蛋白，是主要的中和抗原，是产生中和抗体最强的主要结构蛋白（Maetal，2006）；M蛋白具有很强的免疫原性，同时是最保守的蛋白；N蛋白具有很强抗原性和免疫原性（Larochelleetal，2003）。1.3.3.2PRRSV非结构蛋白PRRSV非结构蛋白(NSP)是由ORF1编码的多聚蛋白分解而成，具有PRRSV聚合酶和IFN抑制的作用。Nsp2是PRRSV感染细胞后最早复制的蛋白之一，同时Nsp2基因是基因组中变异最大的基因之一（Hanetal，2007；马静云等，2008；Zhouetal，2009）；Nsp9和Nsp10具有复制酶功能，Nsp9中含有依赖RNA的RNA聚合酶基序；Nsp10对热及pH较为敏感，含三磷酸核苷结合/RNA螺旋酶基序和金属结合域，具有解旋酶活性（Fangetal，2004）。1.3.4PRRS流行病学PRRS自1996年郭宝清分离病毒以来，逐渐在我国蔓延和流行开来，2006年夏季，该病开始发生并流行于我国南方地区，并很快波及全国各地大部分养猪地区，该病传播具有较高的发病率（70%～100%）和病死率（50%～100%）、速度快、发病广、且治愈率低，造成我国养猪业严重经济损失。猪是PRRSV的唯一自然宿主，猪不分年龄性别和品种均能感染，其中妊娠母猪和仔猪感染的可能性最高，多表现地方性流行。PRRSV感染性很强，病猪的唾液，鼻腔分泌物、尿液、精液、乳汁和粪便等均可作为传染源传播病毒，病毒多以呼吸道等水平方式进行传播，垂直传播也是重要的传播方式。本病的发生无明显的季节性，一年四季均可发生，但以高温、高热、高湿的平原与浅丘陵地区发病较多。在自然流行中，PRRSV仅感染猪，主要侵害繁殖母猪和仔猪，造9 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究成严重的繁殖障碍（母猪流产率高达30%以上）和仔猪的呼吸道疾病。PRRSV在猪体内可持续存在，感染猪长期带毒，病毒在体内可存留数月甚至更长时间，但并不表现症状，当机体免疫抵抗力降低时，即可发病，特别是感染该病毒的母猪未淘汰并作为种猪时，所产的仔猪断奶后发病率和病死率尤其高，从而引起持续性感染。猪群感染PRRSV后并不完全表现症状，有些表现为隐性感染，病毒长期存在，因此带毒的健康猪和隐性感染猪的抗体依赖性增强作用，从而引起疫苗免疫发病。PRRSV感染猪体后会降低其免疫功能，特别是对感染早期的猪免疫功能的抑制作用十分强，引起猪群发生免疫抑制，从而导致多种病原的继发感染或并发感染（王东东等，2009）。1.4猪瘟猪瘟(ClassicSwineFever,CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的—种高度接触性和致死性病毒性传染病，早期在美国被称为猪霍乱(Hogcholera,HC)，相应的其病原称为HCV（Hogcholeravirus），英国称其为猪热病，欧洲一些地区称之为古典猪瘟(Classicalswinefever,CSF)。在我国猪瘟俗称“烂肠瘟”。该病自1810年自美国田纳西州首次报道之后，迅速传播至世界各地，呈世界性分布，并于1903年病毒被证明是猪瘟的病原体。多年来世界各养猪国家均有报道表明猪瘟曾存在或流行于该国，猪瘟传染性强、死亡率高，被认为是与口蹄疫、伪狂犬病等疾病一样严重危害和制约养猪业发展的重要传染病。猪瘟被国际兽医局(OIE)列为A类动物传染病，在我国被列为“一类动物疫病”。全世界皆致力于猪瘟的防制研究，也取得了很大成就，多个国家宣布消灭了猪瘟，但近年来，该病在原已宣布消灭了的欧洲国家又相继出现复发。而1963年宣布消灭猪瘟的加拿大和1976年宣布消灭猪瘟的美国至今没有再爆发过该病（Edwards,etal.2000）。我国1954年研制成功的猪瘟兔化弱毒株(HCLV)，广泛用于猪瘟防制，并取得了很大效果，但近年来，我国的CSF发病率也开始呈上升趋势。1.4.1CSFV病原学特征CSFV属于黄病毒科(Flaviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，与同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)之间有密切的抗原性，既可发生血清学交叉反应又能发生交叉保护作用，而且宿主易感性也相差不大。病毒粒子表观略呈圆形，直径为34～50nm，10 贵州大学2015届硕士研究生学位论文外层包裹有含3种糖蛋白（Ems(Eo)、El和E2）的脂蛋白囊膜，囊膜围绕着等轴的核心，病毒颗粒表面有类似穗样的糖蛋白纤突，长约6～8nm，内部是二十面体对称的核衣壳，由单一C蛋白构成，直径约为30nm(殷震等，1997)。CSFV对外界环境抵抗力不强，其存活时间受含毒介质的影响，且不同毒株对温度和pH的稳定性有一定差别。在细胞培养液中，病毒经56℃处理1h或60℃处理10min即会失活；但在脱纤血中，病毒因含丰富蛋白质经64℃处理1h或经68℃处理30min仍能保持活力且维持其感染性。病毒在pH5～10的条件下能够稳定存在，pH过高或过低病毒的感染性均会迅速降低，在pH2.9条件下室温5小时，病毒滴度即会大幅下降（朱化鹏等，2010）。CSFV对乙醚、氯仿、脱氧胆酸等脂溶剂和皂角素等多种去污剂及常用消毒剂等均有较高敏感性，对胰蛋白酶有中等敏感性，2％氢氧化钠是该病毒的最佳消毒剂。二甲基亚砜(DMSO)可稳定病毒囊膜中的脂质和脂蛋白，因此猪瘟病毒常保存于10％DMSO液中，且对反复冻融有一定抵抗力。病毒与甘油混合后在低温下保存良好，-5～12℃可存活3个月，在蛋白质含量高的环境中，CSFV非常稳定。1.4.2CSFV基因组结构CSFV的基因组为单股正链RNA，大小约12.3kb，由中间一个大的开放阅读框（openreadingframe,ORF）和两端非编码区5'-UTR(untranslatedregion)及3'-UTR构成。其中ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，在翻译的同时或者翻译之后，在特异性蛋白酶和细胞的信号肽酶作用下裂解成12种成熟蛋白；5'-UTR和3'-UTR的长短随毒株序列不同可能有一定差异，同时5'-UTR在毒株基因组中最为保守，尤其是5'端编码第一个结构蛋白的C基因的主要区域保守性极高（王莹等，2006）。CSFV基因组中5’端无帽子结构，病毒蛋白的翻译不依赖帽子结构，且以IRES介导的机制进行，其5’NTR可以驱动下游蛋白翻译的起始，3’端无poly（A）尾结构。CSFV基因组5’和3’-NTR中的二级结构和核苷酸序列相似性均较高。有研究显示，5’NTR和3’NTR是CSFV基因组复制与表达的主要调节区，其中存在的某些顺式作用元件可能是复制起始的识别位点、宿主细胞转录因子的结合位点和核糖体起始蛋白质合成的作用位点。1.4.3CSFV编码蛋白CSFVORF基因编码的多聚蛋白裂解后形成12种成熟蛋白，从N端开始至11 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究C端各蛋白质排列次序如下：Npro(p23)、C（p14）、Erns(gp44/48或E0)、El(gp33)、E2(gp55)、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B（或NH2-Npro-C-E0-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH)。其中包pro括4种结构蛋白（C、E0、E1、E2）和8种非结构蛋白（N、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B），4种结构蛋白是多聚蛋白在翻译过程中依靠细胞内信号肽酶的切割而裂解成的成熟蛋白质，其中3种是糖蛋白，1种是核蛋白，同时Npro、C、Ems、E1、E2、p7、NS27种蛋白参与CSFVRNA的复制，不可缺少(殷震等，1997)。1.4.3.1结构蛋白C蛋白是病毒基因转录的调节因子，参与病毒复制中RNA结构的重组，RNA组装以及病毒形态变化过程，同时C蛋白还具有较强的免疫原性和反应原性(刘坤等，2012)。E0蛋白是CSFV的毒力蛋白和保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，还可以诱导机体淋巴细胞凋亡，以及出现白细胞减少和免疫抑制等现象；同时还参与CSFV吸附进入易感细胞的过程，是唯一能进入细胞培养液中的囊膜糖蛋白（张靖飞，2002；HausmannYetal，2004）。El蛋白是分子量最小的一种囊膜糖蛋白。E2是CSFV最不保守的一种蛋白，也是最主要的保护性抗原蛋白，能够诱导被感染动物机体产生高滴度的中和抗体，还参与病毒吸附进入敏感细胞的过程。1.4.3.2非结构蛋白P7具有较高的保守性，与病毒产生感染性子代病毒有关，还可能与E2蛋白的成熟以及病毒粒子的形成有关(Knutl996；Carrere-KremerSetal，2002)。NS2与NS3由多聚蛋白前体NS2-3水解而成，NS2具有蛋白酶活性，能够参与病毒基因的调控，NS3含有3种病毒复制必需的酶活性，参与病毒致细胞病变过程（XuHetal，2007；ShengCetal，2007）。NS4A具有高度的保守性的磷酸化激酶，参与病毒RNA的复制过程。NS4B具有水解ATP和GTP的作用，参与CSFV基因组的复制，同时还可以通过调节宿主的免疫应答反应发挥毒力作用(刘坤等，2012)。NS5A和NS5B在病毒复制和RNA合成中发挥重要作用（WangYJ,etal.2011）。1.4.4CSF流行病学12 贵州大学2015届硕士研究生学位论文CSF自1810年美国田纳西州首次报道以来，之后遍及世界各地，呈世界性分布，在各养猪国家都有不同程度流行。近30多年来，全世界许多国家均早已采取根除计划，取得了显著成效，成功净化了猪瘟。而且在北美、澳洲和北欧的一些地区曾成功地消灭了猪瘟，但近年来，该病在原已宣布消灭了的国家又相继出现复发，仍广泛存在于世界各地并相互传播。目前该病主要分布于亚洲、南美、欧洲及远东的部分养猪国家和地区，我国猪瘟病毒野毒的平均带毒率为11.58%，带毒范围约为3%~30%，最高者可达33%以上，给养猪业造成巨大的危害和经济损失。猪是CSFV目前已知的唯一自然宿主，包括家猪和野猪，在自然条件下CSFV只感染猪，各种不含母源抗体的非免疫猪不分品种、年龄、性别的猪均可感染发病，目前我国由于长期使用猪瘟疫苗使得仔猪易感性更高。猪瘟的发生无明显季节性，一年四季流行，但一般以春、秋季节较为严重，该病传染性极强，发病率和死亡率皆很高，危害十分巨大。病猪和带毒猪是猪瘟病毒最主要的传染源，猪体一经感染该病毒，即可通过唾液、鼻液、眼泪、尿液、粪便等向外长期大量排毒。猪体的直接接触是CSFV传播的主要方式，消化道、呼吸道、眼结膜、生殖道黏膜和破损皮肤等水平方式也可传播CSFV，胎盘垂直传播也是重要途径。（胡兴权等，2011）近年来，在全世界范围内猪瘟流行和发病特点已发生了明显变化，其流行形式已从以前的大规模的爆发流行转变为周期性、波浪性的地区性散发性流行；在发病特点上，已由以前的初期仅少数几头猪发病，1～2周后大批发病的典型猪瘟逐渐转变为非典型、温和型或亚急性猪瘟，病程延长；发病年龄小，3月龄以内，尤其是断奶前后和出生10日龄以内的仔猪多发，而育肥猪和种猪则很少发病，感染猪群普遍存在免疫力低下；持续性感染、胎盘垂直感染、妊娠母猪带毒综合症、新生仔猪的免疫耐受以及混合感染和并发症等现象呈不断上升趋势(余兴龙，2009)1.5猪细小病毒病猪细小病毒病（Porcineparvovirusinfection,PPI）是由猪细小病毒（Porcineparvovirus,PPV）感染引起的传染病。该病毒是Mary等于1966年用猪肾原代细胞培养猪瘟病毒时发现的，之后被鉴定为是一种DNA病毒（MayrA.etal.,1966）。13 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究其后Cartwight等首次证实了其具有致病性（CartwrightSFetal.,1969）。国内PPV的首次分离是潘雪珠等（潘雪珠等，1983）在上海完成的。自20世纪60年代中期以来，欧洲、美洲、亚洲等很多国家分离到该病毒或检测到其相应抗体。该病以感染母猪，尤其是初产母猪，导致妊娠母猪流产、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及带病弱仔猪等为主要特征（殷震等，1997；Lesteretal.2010；CuiPSetal.,2010）。PPV与PCV2共同作用时能增强PCV2引起的PMWS的症状（Ellis,Aetal.,2000;Allan,eta1.,2000）。而且PPV还常常与乙型脑炎病毒、圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染，从而使疾病的危害更深（胡慧琼等，2004）。1.5.1PPV病原学特征PPV属于细小病毒科（Parvovirus）细小病毒属（Porcineparvovirus）成员。病毒粒子外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径约20～23nm，病毒衣壳是由32个壳粒组成的等轴立体对称的二十面体。PPV病毒粒子包括实心和空心两种，实心PPV为完整病毒粒子，内含ssDNA，具有感染性，可以感染细胞和组织，空心PPV为病毒空壳，不含DNA，不具有感染性，二者均具有血凝活性，可以凝集豚鼠、大鼠、猴、小白鼠、鸡、猫以及人的O型红细胞，其中以对豚鼠红细胞的凝集效果最好(赖笑娴，2010)。该病毒宿主性较强，只能在猪的（包括原代肾、睾丸细胞和传代系PK-15等）和人的某些传代细胞（包括Hela、KB、HEp-2等）中培养增殖。PPV对热抵抗力较强，在4℃条件下十分稳定，可长期保存，在-20℃或-70℃温度下可保存1年以上，且不影响其感染特性和血凝特性，56℃加热处理48h或72℃处理2h，病毒才会丧失传染性和血凝活性，灭活的污染血清虽能够导致PPV感染力下降一定程度，但仍保持其活性不丧失，但在80℃加热处理5min后，病毒感染性和血凝活性即会完全丧失（张宇等，2005）。PPV对各种常见的消毒剂、酶、脂溶剂及有机溶剂也有较强的抵抗力，用胰酶短时间处理病毒悬液，不但不会降低病毒感染性，还会使其感染效价有所提高，这可能是由于胰酶使得病毒粒子在悬液中进一步分散而更充分地接触细胞；自然条件下猪圈及猪排泄物中的PPV至少可生存14周，但0.5%漂白粉或氢氧化钠作用5min，2%戊二醛作用20min，3%甲醛作用2h即可使PPV失去活性，甲醛蒸汽和紫外线杀死PPV的能力较弱，需相较长时间才能使其灭活（郭春红等，2011）。14 贵州大学2015届硕士研究生学位论文1.5.2PPV基因组结构PPV基因组为单股线状DNA分子，成熟的病毒粒子仅含有负链DNA基因组，长约5000bp，基因组3’端和5’端都存在1个发夹结构，3’端包含102bp的回文序列被其中2个含有10bp的短回文序列中断，折叠形成Y型发夹结构；5’端包含127bp的回文序列被1个含有24bp的短回文序列中断，折叠形成U型发夹结构，PPV基因组的这种特殊末端结构对其复制具有非常重要的意义（王芳等，2011；白红光等，2005）。PPV的基因组有两个开放阅读框架(ORF1与ORF2)，分别编码结构蛋白VP和非结构蛋白NS（NS1、NS2和NS3）。整个编码区相互重叠，NS2基因重叠在NS1基因内、NS3基因重叠在NS1和VP1内、VP2基因则重叠在VP1内。编码NS1蛋白的基因是细小病毒属的保守序列，其中有1个GKRN区域，由从第389位氨基酸开始往后的150个左右氨基酸组成，所有细小病毒基因组中都有此段保守序列，因此此段序列可用作细小病毒的诊断探针。PPV3'端具有回折的-OH基，因此该病毒能进行自我复制，具有自主复制性，但病毒复制能力有缺陷，被PPV感染的细胞在有丝分裂过程中染色体复制完成后该病毒才开始在细胞核内合成，形成复制型DNA(RF-DNA)，也就是说PPV的DNA完全依赖于宿主细胞DNA的复制机制而进行自身复制（张宇等，2005）。1.5.3PPV编码蛋白PPV的结构蛋白和非结构蛋白有各自的启动子区域。两个ORFs通过各自启动子的调控，利用不同阅读方式分别转录出各自的mRNA，被修饰后，翻译出2类蛋白质，其中3’端的ORF编码3种结构蛋白VP1、VP2和VP3，VP3是VP2水解后的产物；5’端的ORF编码3种非结构蛋白(即调节蛋白)NS1、NS2和NS3。编码PPV结构多肽和非结构多肽的基因几乎贯穿整个DNA序列，因此形成的病毒粒子能够以极小的空间存在。1.2.5.1PPV结构蛋白PPV结构蛋白是主要免疫原性抗原，病毒空壳仅含VPl和VP2，完整PPV富含VP3。VPlC端氨基酸序列与VP2N端相互重叠，N端是VPl所独有的，在VP1N端有一个介导VPl或其它异种蛋白进入细胞核的脯氨酸丰富区（序列为MAPPAKRAKR）。VP2蛋白是构成病毒粒子衣壳蛋白的主要成分，能自我装配成类病毒粒子，作为载体具有良好抗原转运作用，能诱导产生很强的细胞免疫。15 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究VPl和VP2蛋白共同参与细小病毒DNA的复制及包装，对形成成熟病毒粒子有重要意义，二者还具有稳定病毒单链DNA的作用。VP3只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现。1.5.3.2PPV非结构蛋白PPV非结构蛋白在病毒DNA复制、RNA转录和病毒组装过程都发挥着重要作用。NSl具有解旋活性和抗原性，对于病毒复制必不可少，参与PPV早期和晚期的转录过程和病毒组装，同时在病毒复制时可持续刺激机体产生抗体(崔尚金等，2008)。NS2可调节病毒DNA的复制，但此作用仅限于个别宿主细胞内。1.5.4PPVI流行病学PPVI现在世界范围内广泛分布并在大多数猪场呈地方性流行或散发流行，给全球养猪业造成了的巨大的经济损失。从上世纪60年代中期，PPV的分离和其致病性逐步明确以来，已相继从欧洲、美洲、亚洲等很多国家分离到PPV和检查到其抗体。我国也已先后在北京、上海、吉林、黑龙江、四川和浙江等地分离到PPV，近年来，由于集约化养殖程度的提升，我国猪细小病毒感染也更加严重，全国范围内，猪群PPV的阳性感染率普高于60%，个别省份高达87.50%，经产母猪及种公猪感染阳性率甚至高达90%以上（蔺文成等，2010；王在时，1990）。猪是PPV的唯一宿主，各种年龄、性别、品种的猪均易感，初产母猪感染发病最常见。母猪感染该病后，其胚胎及仔猪的死亡率可高达80%~100%；而本病的流行与猪群的年龄年龄呈正相关，在5~6月龄猪只对本病的感染率为8%~29%，11~16月龄猪只的感染率可高达80%以上（薛浩，2013；鄂美聪，2012）。带毒公猪、母猪和被污染的精液是本病最主要的传染源，通过交配相互传染并通过胚胎传染胎儿，引起胎儿流产、死亡以及木乃伊化，误食含有PPV的食物或接触含有PPV的飞沫、黏液等，经消化道、呼吸道传播也是本病重要的传播途径，鼠类也可机械性传播本病(华江，2014)。猪只感染PPV后1星期内就开始排毒，且排出的病毒对热不敏感，对常用消毒剂也具有抵抗力，使被感染猪场出现较长时期的持续感染。本病一年四季均可发生，但以春、秋季节及母猪配种后猪群易感性更高（洪根等，2012）。1.6猪流感猪流感(Swineinfluenza,SI)是1918年在美国首次发现的由猪流感病毒引起的16 贵州大学2015届硕士研究生学位论文猪的传染病，1930年由ShopeRE首次分离并鉴定出病原，也就是古典型H1N1病毒株。目前已发现的猪流感病毒至少有10种不同血清亚型，即H1N1、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等，其中，H1N1、H3N2和H1N23个亚型在猪群中流行广泛，主要包括古典H1N1、禽类H1N1、人类H3N2、基因重排的H3N2和多基因型的H1N2亚型（王丹丹等，2013）。我国各地猪群广泛流行的猪流感病毒主要是H3N2亚型。SIV是猪呼吸道疾病综合征的主要病原体之一，猪群感染该病毒后常表现为肺部病变，多发生肺炎，还可导致怀孕母猪出现繁殖障碍。单纯感染SIV主要引起机体以突发高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率（几乎100%）、低死亡率（低于1%）为特征的群发性呼吸道疾病（王宏魁等，2011）。SIV可以损害宿主呼吸道上皮细胞，从而常常引起其他细菌和病毒的混合感染和继发感染，使疫病更加复杂，死亡率升高，给养猪业造成巨大危害。1.6.1SIV病原学流感病毒因其核蛋白（Neucleoprotein,NP）和基质蛋白(Matrixprotein,M)抗原性的不同而分为A、B、C三型，A型流感病毒目前已知至少有16种亚型血凝素(Hemagglutinin,HA)和至少9种亚型神经氨酸酶(Neuramidinase,NA)，同时HA和NA是A型流感病毒亚型区分的主要依据（张伟等，2010）。猪流感病毒(Swineinfluenzavirus，SIV)是属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、A型流感病毒属的有囊膜、多态性的RNA病毒，常为球形，有些病毒在初次分离时为长短不一的丝状体，反复经鸡胚和细胞培养传代后均呈球状，直径为80-120nm。SIV由双层类脂囊膜、基质蛋白1（M1）和核衣壳组成，囊膜上有以疏水性氨基酸锚定的3种蛋白突起，即能够凝集红细胞的血凝素，能够使凝集红细胞表面的病毒颗粒释放下来的神经氨酸酶，以及基质蛋白(M)；基质蛋白1形成一个或若干个球形蛋白壳，病毒粒子最内层是呈螺旋状对称的核衣壳，2端具有环状结构，含核蛋白，3种多聚酶蛋白(polymeraseprotein1,PB1;polymeraseprotein2,PB2;polymeraseproteinA)和病毒核酸RNA（吕翠等，2008）。SIV能够很好的在鸡胚尿囊腔、羊膜腔中及狗肾细胞(MDCK)和非洲绿猴肾(Vero)细胞中增殖。SIV具有血凝性，能凝集鸡、驴、猪、绵羊、兔、豚鼠、小鼠、大鼠和人“O”型血红细胞，而这种活性能够被特异性抗体所抑制。17 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究SIV对外界环境稳定性极差，60℃20min或56℃30min病毒即可灭活，在4-40℃温度下，SIV也不稳定，感染性短期内即可丧失，但其血凝活性和其神经氨酸酶活性在4℃条件下可维持数周，-10~-40℃条件下SIV可保存2月，但血凝活性丧，-70℃或冻干后可长期储存；pH3.0~10.0范围时SIV较稳定，过高或过低病毒感染性都会迅速丧失，pH5.0时病毒HA蛋白构型就会发生改变，从而能溶解红细胞；SIV对紫外线敏感，紫外线照射即可使病毒失活。SIV表面有囊膜，对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感性均较高，福尔马林或β-丙内酸也可使病毒灭活，但不破坏其血凝活性和神经氨酸酶活性（王丹丹等，2013）。1.6.2SIV基因组结构SIV基因组为单股负链分节段的RNA，全长约为13.6kb，由8个独立片段组成，各片段大小不等，片段1和片段2最大，8个基因片段的3′端的12个核苷酸和5′端的前13个核苷酸高度保守，序列分别是3'-GGACAAAGAUGAPPP-5'和3'-OH-UCGU/CUUUCGUCC-5'，在病毒转录过程中这些保守序列是重要的核苷酸识别位置，对病毒转录和基因表达起着至关重要的作用（FodorE,etal.,2002）。8个基因片段编码10种基因产物，依次为PBZ、PBI、PA、HA、NP、NA、M(Ml和M2)、NS（NS1和NS2），其中片段1~3分别编码聚合酶PB2、PB1和PA，片段4编码HA，片段5编码NP，片段6编码NA，片段7包括3个读码框，编码基质蛋白(Ml和M2)，片段8最小，包括2个开放阅读框，编码非结构蛋白（NS1和NS2）（余华，2010）。在SIV的8个基因中，编码NP蛋白的基因保守性最高，其次编码M1蛋白和NS2蛋白的基因保守性也很高。1.6.3SIV编码的蛋白SIV编码的蛋白主要包括5种结构蛋白血凝素、神经氨酸酶、核蛋白、聚合酶(Polymerase，PB1、PB2、PA)和基质蛋白(M1、M2)以及1种非结构蛋白（NS1、NS2）。SIV具有较强的抗原性，核蛋白和基质蛋白性质很稳定，是其内部抗原，可通过血清学方法进行区分；血凝素和神经氨酸酶容易发生变异，是其表面抗原。1.6.3.1结构蛋白已经发现的SIV血凝素（HA）有16个亚型，彼此间在血清学方面存在着明显的差异。HA在感染过程中会被水解为两条链HA1和HA2，这是病毒感染细胞的先决条件；该蛋白能刺激机体产生中和抗体，还参与病毒吸附和穿膜过程，18 贵州大学2015届硕士研究生学位论文(董浩等，2011)。HA变异性很强，是病毒发生抗原变异的主要原因（Rohmetal.,1996）。神经氨酸酶（NA）是SIV的表面抗原，与病毒的宿主特异性及病毒的毒力有关，在SIV感染宿主细胞时，NA能促进病毒进入细胞，还能促使病毒粒子成熟和释放（Varghesetal.,1983；Hay,1998）。核蛋白（NP）是病毒核衣壳的主要蛋白成分，同时是一种多功能的蛋白质，能与病毒RNA(vRNA)以及RNA依赖的聚合酶PB2，PB1和PA一起形成RNP复合体以稳定vRNA，使其免受RNAse作用，此外还参与病毒基因组的转录和复制过程，以及病毒的宿主特异性的确定（Gormanetal.,1990）。PB2，PB1和PA统称为聚合酶蛋白，其中PB2和PB1是碱性蛋白，而PA是酸性蛋白，PB2蛋白可以识别并切割宿主mRNA5′末端帽状结构引物；PB1蛋白能够催化新合成RNA链的延伸过程；PA主要在vRNA的复制过程起作用（Hattaetal.,2000）。基质蛋白（M）是病毒粒子中含量最大的蛋白，包括M1和M2。M1是SIV的主要结构蛋白，也是病毒核衣壳的主要组成成分，具有型特异性，流感病毒的分型也部分依赖于其抗原性方面的差异；M2是一种跨膜离子通道蛋白（Zebedeeetal.,1989）1.6.3.2非结构蛋白SIVNS基因在8个基因片段中最短，含有两个ORF，编码NS1和NS2两种蛋白，NS1和NS2大量存在于感染的细胞中，其中NS1在感染的早期大量合成，主要存在于细胞核内，NS2在感染的后期合成生产，主要存在于细胞浆内，对于不同SIV毒株编码的NS1彼此间存在差异，而NS2均高度保守。最初NS1和NS2均被认为是非结构蛋白，但后来发现NS2蛋白在病毒粒子中也有存在，因此，NSl蛋白被认为是唯一的非结构蛋白（Yasudaetal.,1993;Wardetal.,1995）。1.6.4SI流行病学自从1918年猪流感在美国首次报道以来，该病已陆续在欧、美、亚、非、澳等世界各大洲发生和流行，以地方流行为主，但也己造成多次世界性的大流行，包括1918年由H1N1亚型流感病毒引起的西班牙流感、1957年由H2N2亚型流感病毒引起的亚洲流感、1968年由H3N2亚型流感病毒引起的香港流感以及后来由H1N1亚型流感病毒引起的俄国流感，给人类带来了巨大的灾难（于海，19 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究2008）。俄国流感实际上是1977年首发于我国东北地区的流感大流行，近年来，越来越多的调查研究表明，我国猪群普遍受H1亚型和H3亚型SIV感染，且流感抗体阳性率不断上升（谢金文等，2011）。猪流感病毒可感染多种动物使之发病，自然条件下猪、人、火鸡等均能感染该病毒，试验条件下小鼠、雪貂等对其也有敏感性。不同年龄、性别和品种的猪都能感染SIV，病猪、隐性感染猪以及慢性带病毒猪是该病毒的主要传染源，病毒存在于患猪的鼻液、气管和支气管渗出液、肺部淋巴结以及呼吸道粘膜中，随分泌物排出后，主要通过飞沫经呼吸道进行传播，该病毒传播速度极快，通常2～3天即可波及全群(刘贤友2013)。康复猪和隐性感染猪，有一段长期的带毒时间，通常是猪流感再次爆发流行的根源。猪流感一年四季都可发生，但在寒冷的冬季以及天气骤变的晚秋和早春时期发生率更高。单纯的猪流感一般发病率极高，可达100%，但病死率很低，且病猪大多能够迅速康复。SIV可在宿主呼吸道上皮细胞增殖从而破坏其免疫功能，导致容易继发和并发致病菌或病毒等，使得病情加重，感染动物死亡率增加，给养猪业带来极大危害。猪的种间屏障相对较低，除猪流感病毒外还能够感染禽流感病毒和人流感病毒，因此，猪被认为是人、禽和（或）猪流感病毒通过基因重组产生新的亚型流感病毒的“混合器”或活载体，是禽和哺乳动物流感病毒的中间宿主，在流感病毒传播链中起着重要作用。SIV在我国养猪场中普遍存在，难以根除，给畜禽养殖造成了巨大经济损失，同时还对人类健康造成了威胁（ScholtissekC,1990；王丹丹等，2013）。2.病毒检测技术的研究进展疾病的诊断方法有很多，传统的检测方法主要包括动物接种实验、临床诊断和病理组织学检查，血清学检测方法主要包括中和试验（SNT和MSNT）、乳胶凝集试验（LAT）、直接免疫荧光法(AT)、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫扩散试验、血凝试验与血凝抑制试验、补体结合试验、免疫组化法、放射免疫分析（RIA）、对流免疫电泳（CIE）等，分子生物学检测方法主要包括聚合酶链式反应（PCR）诊断技术和核酸探针技术。传统的检测方法虽然比较可靠，但操作比较复杂，而且耗时较长，不利于实际应用；血清学检测方法不需要使用昂贵而复杂的仪器，而且操作比较简单、方便，但灵敏性较差。近年来PCR和cDNA探20 贵州大学2015届硕士研究生学位论文针已成为国际上用于检测病原微生物的主要方法，随着研究的不断深入以及仪器设备的不断发展，具有广阔的应用前景。由于应用cDNA探针方法时，其判断结果受到检测环境及样品的干扰，从而限制了它的临床应用；PCR方法具有特异、灵敏、快速、简便和可直接检测临床样品等优点，已成为检测病毒的有效方法。2.1病毒分离病毒分离是病毒检测的传统方法之一，通常采集患病动物病变组织等病料，经碾磨、稀释和过滤等处理后，取滤过液接种敏感细胞（流感病毒鸡胚接种，效果更好），经不断传代培养以分离病毒。病毒分离对实验技术和实验条件的要求较高，操作也较繁琐，分离周期较长，不利于疾病的快速诊断，而且无法对于大量样本进行检测，难以在临床诊断的应用上进行普及（周贺娟等，2011）。2.2血清中和试验（SNT）SNT是最经典的血清学方法，用于检测中和抗体。其原理是利用被检血清的抗体中和病毒，然后根据培养细胞的病变情况来计算血清抗体的滴度。具体方法是将血清按一定梯度进行稀释，与工作浓度的指示毒等量混合，37℃条件下感作1h。接种于长满单层的细胞瓶，37℃吸附1h后，加病毒培养液，37℃温箱培养72～96h并观察，判定最终结果，单份血清的中和抗体滴度达1：8或超过该比值，判定为阳性。但有些病毒间具有一定的抗原相关性，可能出现假阳性反应。因此，在进行大批量的血清学检测时，可以先用SNT作为初步检测，然后再用其他方法对阳性病料进行诊断。2.3荧光抗体染色法该方法可直接镜检组织冰冻切片。采取可疑病猪的病变组织做成冰冻切片，并用荧光抗体诊断液进行染色，将已染色的标本片置湿盒中，放入37℃培养箱作用30min。取出用PBS液(pH值7.2～7.6)冲洗和漂洗15min（中间换液1次），再用去离子水冲洗除盐，放置标本片让其自然干燥，然后滴加磷酸甘油，盖上洁净的盖玻片，放于荧光显微镜下观察。荧光抗体染色法较HI敏感度高，是—种特异性强、检出率高且快速的诊断方法。2.4ELISA检测ELISA方法是以生物技术手段制备的抗原检测试剂和单克隆抗体制剂为基21 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究础建立的检测方法。该方法是多种疾病诊断的较佳血清学方法，此方法具有特异性强、敏感性高、耗时短，成本低，操作简便，试剂长期有效，而且可以用于大范围的血清学调查和监测大批量检测样品，可重复性好、所用试剂容易购买并且配制简单、使用仪器设备少等优点，目前已有很多商品化的ELISA试剂盒用于动物疫病的快速诊断。近年发展了Dot-ELISA、快速ELISA等方法，也具有较高的灵敏度，且只需要很少的试剂，时间短、操作简单，可以检测粪便上清液中的病毒抗原，是今后疫病诊断发展的方向。2.5聚合酶链式反应（PCR）PCR（polymerasechainreaction）方法是实验室检测微生物的一种有效工具，可以从微量的核酸样品中检测出DNA或RNA序列，这种方法不需进行病毒分离，具有快速准确，有较高的特异性和敏感性、费时少等优点，还可以对活体进行检测。在PCR技术的基础上，发展出了一些具有更好检测效果的PCR方法，如多重PCR方法、巢氏PCR方法、实时PCR法等，这些方法在疾病诊断上已得到较广泛的应用。2.5.1常规PCR/RT-PCRPCR/RT-PCR方法是一种特异、敏感、快速的诊断方法，可用于检测微量病毒。该方法操作简便，适合大规模临床样本的检测，在流行病学的调查当中具有重要意义。利用PCR/RT-PCR扩增待检病毒保守区域，根据PCR产物的电泳结果与预测的核酸分子质量大小相比较，判定样品中是否存在该病毒。2.5.2多重PCR/RT-PCR法多重PCR/RT-PCR(MultiplexPCR/RT-PCR)，又称多重引物PCR/RT-PCR或复合PCR/RT-PCR，是在同一PCR/RT-PCR反应体系中加入2对以上引物，同时扩增出多种靶序列的PCR/RT-PCR反应。该方法可用于同时检测或鉴定多种病原微生物以及病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，但该方法要求设计的引物必须具有特异性。刘志杰等建立了可以同时检测PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV和JEV的六重PCR诊断方法，该方法具有较高的敏感性和特异性以及快速、省时省力等优点（刘志杰等，2012）。2.5.3巢式PCR法22 贵州大学2015届硕士研究生学位论文巢式PCR是利用两对PCR引物扩增目的片段的方法。它利用第一对引物扩增15～30个循环，再用第一次扩增的DNA片段内设定的第二对引物扩增15～30个循环，使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构扩增较少。该方法比常规PCR方法更加特异，并且当样品内病原微生物含量极低时，常规PCR不一定能检测到，但是巢式PCR可以克服该问题，进行更加微量的DNA检测。巢式PCR灵敏度更高，特异性更强，但需要昂贵的试剂及熟练的操作人员，极大地限制了其应用。2.5.4环介导的等温扩增反应环介导的等温扩增反应(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，是利用两至三对引物(包括一对外部引物、一对内部引物和一对环引物)和链置换DNA聚合酶，在等温条件下，几十分钟就可扩增出靶序列。由于该方法用时短，对设备要求低，且比普通PCR的敏感性高，非常适合于基层和现场操作使用。2.5.5实时PCR法实时PCR(Real-timePCR)，又称荧光定量PCR(fluorescentquantitativepolymerasechainreaction，FQ-PCR)或TaqManPCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法具有高敏感性、高特异性、高通量、重复性好、定量准确、速度快等优点，适用于病毒感染的检测，尤其是感染早期检测。1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测仪。目前，已广泛应用于分子生物学研究领域，特别是近几年来在动物疫病病原体的定性和定量方面得到了广泛应用。2.6核酸探针杂交试验核酸探针杂交试验是一种以碱基互补为基础的分子生物学检测方法，通过标记的核酸片段与互补的DNA或RNA结合，然后利用标记物显色或发光来指示结果。该方法灵敏性高、特异性高、方法简便，标记物有同位素标记(32P、35S等)、生物素标记等，特别适用于疾病的早期诊断和类症鉴别诊断，是近二十年来应用较多的一项诊断技术。原位杂交使用的核酸探针可以是放射性探针(如，2P标记)，也可以是非放射性探针(如地高辛标记)。侯喜林等用地高辛对猪细小病毒标记后制备探针，并以此对多株PPV病毒及具有相同临床症状的猪瘟病毒、日本乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒等进行检测（侯喜林等，1998）。核酸探针技术与HA、SN相比，其特异性和敏感性更高，但该方法要求更高的技术含量，无法23 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究用于大面积临床诊断和现场应用。3．PCR诊断方法的研究进展与应用聚合酶链反应(polvmerasechainreaction，PCR)又称体外基因扩增，是一种体外扩增特异性DNA的技术。该技术是1984年由美国PE公司KaryB，Mullis发明的，1976年，Chirn分离出了热稳定多聚酶，其后Erlich于1986年分离并纯化了耐热性多聚酶Taq以适用于PCR，接着Saiki于1988年开始使用多聚酶Taq进行PCR扩增，从此PCR开始真正意义的使用（MullisK，etal.1986)。在之后的时间里，PCR技术持续发展与改进，日益成熟，各种PCR技术不断建立与完善，RT-PCR、巢式PCR、实时定量PCR、差异显示PCR、免疫PCR、递减PCR、嵌套PCR、多重PCR等技术也逐步更新，目前PCR技术已经成为了分子生物学实验室的一项基本技术，广泛应用于遗传性疾病的诊断、传染病原的检测、活化癌基因的研究和等位基因序列分析等许多方面，并发挥了重要作用。随着生命科学和医学检测的不断发展，以及疫病混合感染现象的越来越普遍，PCR技术不断朝着在保证反应特异性、灵敏性、保真度的同时，尽量缩短反应时间的方向发展，而多重PCR技术恰有此优点（杨文超等，2007；LeeCS，etal.2007）。当前，多重PCR技术不仅在病原微生物检测中具有重要的应用价值，还被广泛应用于基因诊断、遗传学、植物生物及海洋生物等研究领域中（Liu，etal.2005）。借助多重PCR技术，人类已经攻克了许多科学难题，取得了巨大突破。如今多重PCR已经在这一领域广泛应用，它结合传统经典的检测手段，为疾病的快速灵敏特异的诊断和最佳治疗方案的确定展示了广阔的前景，随着科学的发展，技术的进步，多重PCR必将得到更快的发展。多重PCR即是在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上特异性引物，同时扩增多种病原微生物部分基因或多个基因的分子生物学诊断方法。其反应原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同。多重PCR技术自1988年被Chamberlain等人首先应用于检测人的杜氏肌营养不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)外显子基因以来，在诸多领域，尤其是核酸诊断领域，得到了广泛深入的研究及应用。在此基础上，进一步发展了诸如巢式多重PCR、荧光定量多重PCR、差异显示多重PCR等系列相关技术。随着多重PCR技术广泛应用与人医临床诊断，WirzB等人于1993年首次将该技术应用于兽医诊断领域，用于鉴别猪瘟病毒和其他瘟病毒24 贵州大学2015届硕士研究生学位论文属的病毒，拉开了兽医诊断领域应用多重PCR的序幕（胡晓霞，2013）。之后不断被报道多种动物细菌性、寄生虫性、病毒性疾病用该技术进行诊断。由于多重PCR实验设计较单项PCR更为复杂，技术难度更大，因而在建立多重PCR反应体系时，必须对其中的主要成分和反应条件进行一系列繁琐的优化。4．研究的目的和意义现代养猪业已经逐步朝着规模化和集约化发展，但随着规模化和集约化程度的越来越高，猪群多病原引发的混合感染和继发感染情况也越来越普遍，猪病的复杂程度及其危害也与日俱增，猪传染病混合感染和继发感染的发生和流行成为制约养猪生产的重要因素。PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV与SIV6种病原在猪场常发生的各类呼吸道病毒性疫病中最为多见，是主要的呼吸道病毒性疫病病原，同时也都可以导致猪群出现繁殖障碍，且感染后的猪群临床症状比较相似，而且PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV均可以不同程度地损伤机体免疫系统，降低机体对外界的抵抗能力，引起继发性混合感染，因此该六种病毒中几种病毒混合感染情况比较常见，尤以2~3种病毒混合感染最为普遍，使得动物疫病复杂化，病症加重。本研究拟针对该六种病毒保守基因序列分别设计一对特异性引物，以各病毒的阳性基因组核酸为模板，通过对其条件的优化，建立可在一个反应体系中同时鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV感染的多重PCR方法，以期为临床病料的快速准确检测、流行病学调查、防制并净化疫病提供技术帮助。25 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究第二章PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的PCR/RT-PCR方法的建立近年来，养猪场猪群传染病的流行主要以多病原混合感染和呼吸道传染病的普遍存在为特征，特别是猪病毒性呼吸道疫病是目前我国规模化猪场的常发病和多发病。猪呼吸道疫病是由多种因素共同作用引起的，病毒、细菌、支原体、寄生虫、不良的饲养管理条件及低抵抗力猪群等皆能够引起该病的发生（张家恭，2008）。猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪流感病毒是最为常见的猪病毒性呼吸道疾病病原，这些病毒感染猪群后，严重危害机体健康，病猪表现为生长缓慢、饲料报酬低、发热、咳嗽、呼吸困难，因此对呼吸道疫病进行快速、准确的诊断十分有意义（赵朴等，2014）。1材料1.1病毒PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV系贵州省动物疫病研究室鉴定并传代保存；SIV系从病料中获得。1.2主要试剂TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0、TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0、DL2000DNAMarker、pMD19-TVector等均购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa公司）；TMGelExtractionKit试剂盒和E.Z.N.A.PlasmidMiniKit质粒提取试剂盒，为OMEGA公司产品；IPTG和X-gal，为美国Sigma公司产品；GoldView，为Hyclone公司产品；琼脂糖，为Biowest公司产品；异丙醇、无水乙醇等为国产分析纯试剂。1.3主要溶液的配制1.3.150×TAE冰醋酸57.1mLTris242g0.5MEDTA(PH=8.0)100mL26 贵州大学2015届硕士研究生学位论文加蒸馏水至1000mL，高压灭菌15min。1.3.22×YT液体培养基胰化蛋白胨16g酵母提取物10gNaCl5g加去离子水至800mL，用1MNaOH调pH为7.0，补加去离子水至1000mL，分装高压后，室温保存。1.3.32×YT琼脂培养基在2×YT液体培养基中加如琼脂粉至终浓度为1.5%（W/V），高压灭菌，待温度降至60℃以下时，加入100μg/mL的Amp，然后倾倒平皿。1.3.4Amp贮存液（200mg/mL）Amp5g去离子水25mL溶解后过滤除菌，分装，于-20℃保存。1.3.5X-Gal贮存液X-Gal20mg二甲基甲酰胺1mL溶解后过滤除菌，于-20℃避光保存。1.3.6细菌保存液甘油20mL生理盐水20mL混合均匀，于-20℃保存。1.4主要实验仪器梯度PCR扩增仪、ThermoForma-80℃超低温冰箱和GelDOCXR凝胶成像系统，美国BIO-RAD有限公司；HZS-H水浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂；MVS-1旋涡混合器，北京金北德工贸有限公司；DYY-7C型电泳仪和电泳槽，北京市六一仪器厂；精悬电子天平，西特传感技术（天津）有限公司；27 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究紫外线透射反射分析仪(ZFA型)，上海骥辉分析仪器有限公司；生物安全柜(BSC-1300Ⅱ型)、数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司。2方法2.1引物设计与合成参照NCBI中PRVgB（AF257079）、PCV2ORF2（NC_005148）、PRRSVORF6（NC_001961）、CSFVC（AY805221）、PPVNS1（NC_001718）、SIVM（GU086140）等基因序列，应用多重PCR引物设计系统Mpprimer（王稳等，2010；ShenZetal.,2010）和多因素引物特异性评估系统MFEprimer（QuWetal.,2009;QuWetal.,2012）设计多重PCR引物，用于扩增目的基因片段，引物序列详见表1。表1扩增目的片段的引物Table1Specificprimersusedtoamplifytargetgenes病毒目的基因引物序列(5′-3′)片段大小/bpVirusTargetgenePrimersequence(5′-3′)ProductlengthR1：5′-ATGGTGGAGGTGCCCG-3′PRVgB192F1：5′-GACCACGCGGTCAATGTCG-3′R2：5′-GGCGGTGGACATGCTGAGAT-3′PCV2ORF2255F2：5′-TGGGGGATTGTATGGCGGG-3′R3：5′-GGCCGACTGCTAGGGCTTTT-3′PRRSVORF6364F3：5′-TTCTGCCACCCAACACGAGG-3′R4：5′-GTCAGTAGTTCGACGTGAGCAG-3′CSFVC530F4：5′-ACCTCGCAGAACTGCACTT-3′R5：5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′PPVNS1759F5：5′-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3′R6：5′-TTAAAGATGAGCCTTCTGACCGAGG-3′SIVM981F6：5′-AGCGCTATGTTGACAAAATGACC-3′2.2病毒核酸的提取按TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0提取试剂盒说明书进行病毒DNA的提取，按TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0提取试剂盒说明书进行病毒RNA的提取。2.3病毒核酸的PCR/RT-PCR扩增分别加入相应的引物进行PCR/RT-PCR扩增，反应体系如下：28 贵州大学2015届硕士研究生学位论文PRV、PCV2、PPVPCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30S，57℃30S，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PRRSV、CSFV、SIVRT-PCR扩增条件为：50℃反转录40min；95℃预变性5min；95℃30S，57℃30S，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，分别取5µLPCR/RT-PCR产物进行电泳，观察结果并分析鉴定。2.4PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV目的基因的鉴定2.4.1目的基因的回收纯化将PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV电泳结果出现目的条带的剩余PCR/RT-PCR产物全部电泳，利用GelExtractionKit试剂盒回收和纯化目的DNA片段，具体操作步骤参照说明书。2.4.2目的基因与pMD19-T载体的连接将成功扩增的PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV基因分别与pMD19-T载体连接，构建重组克隆质粒。连接体系如下：目的DNA6.0µLpMD19-T1.0µLSolutionⅠ8.0µL总体积15.0µL将以上试剂加入PCR管中，混匀，于PCR仪中16℃连接12～16h。2.4.3重组质粒的转化具体操作步骤如下：（1）从-80℃超低温冰箱中取出Top10感受态细胞，冰上溶解10min。（2）取连接产物10µL与100µL的感受态细胞轻轻混匀（用枪头轻轻搅拌几下）后，冰浴30min。（3）取出后42℃水浴90s，然后迅速放入冰浴中，静置3～5min。（4）向管内加入800μL的37℃预热2×YT培养液。（5）37℃摇床120r/min振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达r质粒编码的抗生素抗性基因(Amp)。29 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究（6）室温条件下，6000r/min离心10min，弃去700μL上清，用剩余液体悬浮细菌沉淀。（7）用三角玻璃推子在含Amp（50μg/mL）的2×YT琼脂培养基上均匀涂布8μLIPTG(20mg/mL)和40μLX-gal(20mg/mL)，然后将细菌悬液将菌液均匀涂布平板上，置37℃温箱培养正面放置5～10min，待完全吸收后倒置培养皿培养12～16h后，观察蓝白菌落的出现。2.4.4重组质粒的抽提从上述平板中（蓝白挑选的）挑取白色菌落分别接种于含Amp（50μg/mL）的2×YT液体培养基中振荡培养过夜，然后用E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKit试剂盒提取重组菌的质粒DNA并保存重组菌，具体步骤参照试剂盒说明书。2.4.5重组质粒的DNA序列测定及分析对提取的质粒DNA分别进行PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIVPCR/RT-PCR扩增，将电泳结果出现正确目的条带的菌液送Invitrogen公司测序鉴定。2.5单项PCR/RT-PCR诊断方法的建立2.5.1单项PCR/RT-PCR反应2.5.1.1单项PCR/RT-PCR反应体系的建立在PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV目的基因扩增结果的基础上，逐步确定6种病毒上下游引物（0.5µL、1µL、1.5µL、2µL），以确定最佳反应体系。2.5.1.2单项PCR/RT-PCR反应条件的优化对单项PCR/RT-PCR反应预设置7个梯度的退火温度（51℃、53℃、55℃、56℃、57℃、58℃、60℃）进行优化，以确定最佳退火温度。2.5.2单项PCR/RT-PCR敏感性试验单项病毒PCR/RT-PCR反应的敏感性参照殷震和ElnnifroEM等（ElnnifroEMetal，2000）的方法进行。将提取的PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，用灭菌三蒸水做10倍系列稀释，然后取每个稀释度的病毒模板各1µL分别进行PCR/RT-PCR反应。30 贵州大学2015届硕士研究生学位论文3结果3.1单项PCR/RT-PCR诊断方法的建立3.1.1单项PCR/RT-PCR反应3.1.1.1病毒核酸的单项PCR/RT-PCR扩增取PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV阳性病毒液各200µL，按照RNA/DNA提取试剂盒说明书分别进行核酸的提取，并进行PCR/RT-PCR检测，以确定引物扩增的有效性。结果PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV模板均扩增出与目的片段大小符合的特异性条带。各扩增片段的克隆测序结果表明，所扩增片段与预期结果大小一致，系目的基因序列。扩增结果见图1。图AM:DL2000Marker,N:阴性对照,1:PRVPCR产物;图BM:DL2000Marker,N:阴性对照,1:PCV2PCR产物;图CM:DL2000Marker,N:阴性对照,1:PRRSVPCR产物;图DM:DL2000Marker,N:阴性对照,1:CSFVPCR产物;图EM:DL2000Marker,N:阴性对照,1:PPVPCR产物;图FM:DL2000Marker,N:阴性对照,1:SIVPCR产物Fig.AM:DL2000Marker,N:Negativesamples,1:PCRproductsofPRV;Fig.BM:DL2000Marker,N:Negativesamples,1:PCRproductsofPCV2;Fig.CM:DL2000Marker,N:Negativesamples,1:PCRproductsofPRRSV;Fig.DM:DL2000Marker,N:Negativesamples,1:PCRproductsofCSFV;Fig.EM:DL2000Marker,N:Negativesamples,1:PCRproductsofPPV;Fig.FM:DL2000Marker,N:Negativesamples,1:PCRproductsofSIV图1PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIVPCR/RT-PCR检测结果Fig.1DetectionresultsofthePCRforPRV,PCV2,PRRSV,CSFV,PPVandSIV3.1.1.2单项PCR/RT-PCR反应体系的建立通过对固定阳性样品模板改变引物浓度的系列试验，确定最佳引物量。结果表明在6对引物中，PPV、PRRSV各1µL，PRV、PCV2、CSFV、SIV上下游引物各1.5µL时PCR/RT-PCR检测效果最明显。（1）PRV、PCV2、PPV最佳反应体系：反应体系为50µL，10PCRbuffer5µL，dNTPs1µL，上下游引物各1µL（PRV）/1.5µL（PCV2）/1.5µL（PPV），模板DNA1µL，rTaq2µL，ddH2O各39µL、38µL、31 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究38µL。（2）PRRSV、CSFV、SIV最佳反应体系：反应体系为25µL，2×1StepBuffer12.5µL；PrimeScriptOneStepEnzymeMix1μL；上下游引物各1µL（PRRSV）/1.5µL（CSFV）/1.5µL（SIV）；模板各1µL；RNaseFreeH2O各9µL、8µL、8µL。3.1.1.3单项PCR/RT-PCR反应条件的优化对单项PCR反应的退火温度（51～60℃）进行优化，以确定最佳反应条件。实验结果表明：（1）PRV、PCV2、PPV最佳反应程序：反应程序：95℃5min；95℃30s，56.0℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。优化扩增效果见图2～4。（2）PRRSV、CSFV、SIV最佳反应程序：反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s，55.0℃（PRRSV）/56.0℃（CSFV）/57℃（SIV）30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。优化扩增效果见图5～7。M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：53.0℃；3：55.0℃；4：56.0℃；5：57.0℃；6：58.0℃；7：60.0℃图2PRV退火温度优化Fig.2TheoptimizationofannealingtemperatureofPRV32 贵州大学2015届硕士研究生学位论文M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：53.0℃；3：55.0℃；4：56.0℃；5：57.0℃；6：58.0℃；7：60.0℃图3PCV2退火温度优化Fig.3TheoptimizationofannealingtemperatureofPCV2M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：53.0℃；3：55.0℃；4：56.0℃；5：57.0℃；6：58.0℃；7：60.0℃图4PPV退火温度优化Fig.4TheoptimizationofannealingtemperatureofPPVM：DL2000Marker；1：51.0℃；2：53.0℃；3：55.0℃；4：56.0℃；5：57.0℃；6：58.0℃；7：60.0℃图5PRRSV退火温度优化Fig.5TheoptimizationofannealingtemperatureofPRRSV33 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：53.0℃；3：55.0℃；4：56.0℃；5：57.0℃；6：58.0℃；7：60.0℃图6CSFV退火温度优化Fig.6TheoptimizationofannealingtemperatureofCSFVM：DL2000Marker；1：51.0℃；2：53.0℃；3：55.0℃；4：56.0℃；5：57.0℃；6：58.0℃；7：60.0℃图7SIV退火温度优化Fig.7TheoptimizationofannealingtemperatureofSIV3.1.2单项PCR/RT-PCR敏感性试验在单项病毒的PCR反应中，各病毒的最低检测量分别为PRV2.5pg、PCV22.2pg、PRRSV3.2pg、CSFV8.3pg、PPV3.7pg、SIV3.7pg（图8～13）。34 贵州大学2015届硕士研究生学位论文-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.Dilutedat10；2.Dilutedat10；3.Dilutedat10；4.Dilutedat10；5.Dilutedat10；图8PRVPCR的敏感性试验Fig.8SensitivitytestofthePCRforPRV-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.Dilutedat10；2.Dilutedat10；3.Dilutedat10；4.Dilutedat10；5.Dilutedat10；图9PCV2PCR的敏感性试验Fig.9SensitivitytestofthePCRforPRV-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.Dilutedat10；2.Dilutedat10；3.Dilutedat10；4.Dilutedat10；5.Dilutedat10；图10PRRSVPCR的敏感性试验Fig.10SensitivitytestofthePCRforPRV35 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.Dilutedat10；2.Dilutedat10；3.Dilutedat10；4.Dilutedat10；5.Dilutedat10；图11CSFVPCR的敏感性试验Fig.11SensitivitytestofthePCRforPRV-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.Dilutedat10；2.Dilutedat10；3.Dilutedat10；4.Dilutedat10；5.Dilutedat10；图12PPVPCR的敏感性试验Fig.12SensitivitytestofthePCRforPRV-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.Dilutedat10；2.Dilutedat10；3.Dilutedat10；4.Dilutedat10；5.Dilutedat10；图13SIVPCR的敏感性试验Fig.13SensitivitytestofthePCRforPRV36 贵州大学2015届硕士研究生学位论文4讨论近年来，猪病毒性呼吸道疫病是目前我国规模化猪场的常发病和多发病，该病由多因素多病原引起，给我国养猪业带来极大的经济损失。猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪流感病毒是最为常见的猪病毒性呼吸道疾病病原，感染猪群后，严重危害机体健康（赵朴等，2014）。以上六种病毒感染猪群后均可以不同程度地损伤机体免疫系统，从而降低机体对外界的抵抗能力，引起继发性混合感染，导致疫病复杂化，病症加重。近年来猪场呼吸道病毒性疫病发生时多表现为多种病原的混合感染或继发感染，导致猪群发病率和死亡率增高，给养猪业造成了巨大的经济损失，而对猪场发生的疫病进行快速准确的诊断是对有效防治疾病的前提，因此，能快速准确的诊断临床病料的方法有很大的应用价值(王洪光等，2015)。本实验针对PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV等6种常见DNA/RNA病毒的相关保守基因分别设计了一对特异性引物，以扩增PRVgB、PCVORF2、PRRSVORF6、CSFVC、PPVNS1、SIVM等部分基因片段，通过对目的基因的扩增、胶回收、克隆转化等，成功构建了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV的克隆载体并对目的基因进行了测序鉴定，通过对PCR条件的优化，建立了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV单项PCR/RT-PCR检测方法，为构建检测猪呼吸道病毒性疫病的多重PCR方法打下基础。5结论（1）成功构建了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV的克隆载体；（2）成功构建了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV单项PCR/RT-PCR的鉴别诊断方法。37 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究第三章PRV、PCV2和PPV三重PCR方法及PRRSV、CSFV和SIV三重RT-PCR方法的建立及初步应用研究随着现代养猪业规模化和集约化的发展，猪群发生多病原混合感染和继发感染的情况越来越普遍（Ogawaetal，2009）。目前，猪呼吸道疾病与猪繁殖障碍性疾病是影响养猪业发展的主要疾病，是目前我国规模化猪场的常发病、多发病，已经引起人们的普遍重视，给我国养猪业带来极大的经济损失。在猪场常发生的病毒性呼吸道疾病中，以猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪流感病毒（SIV）等6种病原最为多见，其中PRV、PCV2和PPV是重要的DNA病毒，PRRSV、CSFV和SIV是重要的RNA病毒；同时PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV还均可以不同程度地损伤机体免疫系统，降低机体对外界的抵抗能力，引起继发性混合感染，导致疫病复杂化，病症加重（Laila，etal2012；Merijn，etal2011；Suresh，etal2010；Immanuel，etal2013；谢金文等，2011）。自PCR技术于1988年首次被Chamberlain等用于诊断杜式肌营养不良症以来，该诊断技术在诸多领域得到了广泛的研究和应用，尤其在核酸诊断领域应用最为深入。多重PCR是在PCR技术基础上发展而来的，不仅具有一般PCR技术特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低等优点，而且能够同时检测多种病原，能够对疾病做出快速、准确的诊断，适合临床病料中病原体的快速检测，尤以对多病原混合感染病料的病原检测效果更为明显（Bellau-Pujoletal，2005）。1材料1.1病毒见第二章1.11.2临床病料36份病料采自2014年贵州省不同地区养猪场的疑患呼吸道病毒性疫的病死猪肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结等，每头猪的各种组织混合为1份病料。1.3主要试剂TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0、TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0、DL2000DNAMarker等均购自大连宝生物工程有限公司；38 贵州大学2015届硕士研究生学位论文GoldView，为Hyclone公司产品；琼脂糖，为Biowest公司产品；异丙醇、无水乙醇等为国产分析纯试剂。1.4主要实验仪器梯度PCR扩增仪、ThermoForma-80℃超低温冰箱和GelDOCXR凝胶成像系统，美国BIO-RAD有限公司；DYY-7C型电泳仪和电泳槽，北京市六一仪器厂；精悬电子天平，西特传感技术（天津）有限公司；紫外线透射反射分析仪(ZFA型)，上海骥辉分析仪器有限公司；生物安全柜(BSC-1300Ⅱ型)、数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司。2方法2.1引物设计与合成见第二章2.12.2病毒核酸的提取按TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0说明书进行PRV、PCV2和PPVDNA的提取，按TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0说明书进行PRRSV、CSFV和SIVRNA的提取。2.3PRV、PCV2、PPV三重PCR方法的建立2.3.1三重PCR反应2.3.1.1三重PCR反应体系的建立在PRV、PCV2、PPV目的基因扩增结果的基础上，逐步确定3种病毒上下游引物（0.5µL、1µL、1.5µL、2µL），以确定最佳反应体系。2.6.1.2三重PCR反应条件的优化对三重PCR反应预设置7个梯度的退火温度（51℃、53℃、55℃、56℃、57℃、58℃、60℃）进行优化，以确定最佳退火温度。2.3.2三重PCR敏感性试验三重PCR反应的敏感性参照殷震和ElnnifroEM等（ElnnifroEMetal，2000）的方法进行。将提取的PRV、PCV2、PPV病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，用灭菌三蒸水做10倍系列稀释，然后取每个稀释度的病毒模板各1µL分别进行PCR反应。39 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究2.3.3特异性试验分别以PRV、PCV2、PPV、PRRSV、CSFV核酸为模板进行三重PCR反应。2.3.4三重PCR对临床病料的检测利用已建立的三重PCR方法对收集于贵州省内的共36份临床病料进行检测，分别取病死猪混合病料反复冻融3次充分研磨后转入组织匀浆器中充分匀浆，于离心机中12000r/mim离心5min，各取200μL，参照核酸提取试剂盒说明书，按步骤提取病毒DNA，其余操作按照前述的方法进行。2.4PRRSV、CSFV、SIV三重RT-PCR方法的建立2.4.1三重RT-PCR反应2.4.1.1三重RT-PCR反应体系的建立在PRRSV、CSFV、SIV目的基因扩增结果的基础上，逐步确定3种病毒上下游引物（0.5µL、1µL、1.5µL、2µL），以确定最佳反应体系。2.4.1.2三重RT-PCR反应条件的优化对三重RT-PCR反应预设置7个梯度的退火温度（51℃、53℃、55℃、56℃、57℃、58℃、60℃）进行优化，以确定最佳退火温度。2.4.2三重RT-PCR敏感性试验三重RT-PCR反应的敏感性参照殷震和ElnnifroEM等（ElnnifroEMetal，2000）的方法进行。将提取的PRRSV、CSFV、SIV病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，灭菌三蒸水做10倍系列稀释，然后取每个稀释度的病毒模板各1µL分别进行RT-PCR反应。2.4.3特异性试验分别以PRRSV、CSFV、SIV、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、PPV、PCV2、核酸为模板进行三重RT-PCR反应。2.4.4三重RT-PCR对临床病料的检测利用已建立的三重PCR方法对收集于贵州省内的共36份临床病料进行检测，分别取病死猪混合病料反复冻融3次充分研磨后转入组织匀浆器中充分匀浆，于离心机中12000r/mim离心5min，各取200μL，参照核酸提取试剂盒说明书，按步骤提取病毒RNA，其余操作按照前述的方法进行。40 贵州大学2015届硕士研究生学位论文3结果3.1三重PCR诊断方法的建立3.1.1三重PCR反应3.1.1.1多重PCR反应体系的建立通过对固定阳性样品模板改变引物浓度，确定最佳引物量。结果表明三重PCR反应在50μL反应体系中最佳反应条件为：上下游引物浓度PRV各0.5μL、PCV2各1.5μL、PPV各1.0μL。当反应循环次数为35，退火温度56℃，多重PCR扩增效果最佳（见图14）。最佳反应程序：反应体系为50µL，其中10PCRBuffer5µL；dNTPs1µL；rTaq2μL；上下游引物PRV各0.5µL；上下游引物PPV各1µL；上下游引物PCV2各1.5µL；模板PRV、PCV2、PPV各1µLRNaseFreeH2O33µL。反应程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。优化扩增结果见图14。M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：53.0℃；3：55.0℃；4：56.0℃；5：57.0℃；6：58.0℃；7：60.0℃图14PRV，PCV2，PPV三重PCR退火温度优化Fig.14TheoptimizationofannealingtemperatureofmPCRforPRV,PCV2andPPV3.1.2敏感性试验在多重PCR反应中，各种病毒的最低检测量分别为PRV2.5pg、PCV2.2pg、41 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究PPV3.7pg(见图15)。-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.Dilutedat10；2.Dilutedat10；3.Dilutedat10；4.Dilutedat10；5.Dilutedat10；图15PRV，PCV2，PPV三重PCR的敏感性试验Fig.15SensitivitytestofthemPCRforPRV,PCV2andPPV3.1.3特异性试验用已确定的三重PCR反应条件进行特异性试验，结果表明PRRSV、CSFV模板均未扩增出条带，而PRV、PCV2、PPV模板均扩增出与目的片段大小相符的特异性条带（图16）。M:DL2000Marker;1:PRV,PCV2和PPV混合PCR产物;2-6:依次为PRV/PCV2/PPV/PRRSV/CSFVPCR产物M:DL2000Marker;1:PCRproductsofPRV,PCV2andPPV;2-6:PCRproductsofPRV/PCV2/PPV/PRRSV/CSFV图16PRV，PCV2，PPV三重PCR的特异性试验Fig.16SpecificitytestofthemPCRforPRV,PCV2andPPV3.1.4多重PCR对临床病料的检测36份临床病料检测结果表明，PRV感染阳性率为8.3%（3/36），PCV2感染42 贵州大学2015届硕士研究生学位论文阳性率为33%（12/36），PPV感染阳性率为2.8%（1/36）；二重感染阳性率达2.8%（1/36）；三重感染阳性率达0%（0/36）。结果单项PCR方法检测符合率为100%。3.2三重RT-PCR诊断方法的建立3.2.1多重RT-PCR反应3.2.1.1多重PCR反应体系的建立通过对固定阳性样品模板改变引物浓度，确定最佳引物量。结果表明三重PCR反应在50μL反应体系中最佳反应条件为：上下游引物浓度PRRSV、CSFV各1μL、SIV各1.5μL。当反应循环次数为35，退火温度57℃，多重PCR扩增效果最佳（见图17）。最佳反应程序：反应体系为50µL，其中2×1StepBuffer25µL；PrimeScriptOneStepEnzymeMix2μL；上下游引物PRRSV、CSFV各1µL；上下游引物SIV各1.5µL；模板PRRSV、CSFV、SIV各1µLRNaseFreeH2O13µL。反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。优化扩增结果见图17。M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：53.0℃；3：55.0℃；4：56.0℃；5：57.0℃；6：58.0℃；7：60.0℃图17PRRSV，CSFV，SIV三重RT-PCR退火温度优化Fig.17TheoptimizationofannealingtemperatureofmPCRforPRRSV,CSFVandSIV3.2.2敏感性试验在多重PCR反应中，各种病毒的最低检测量分别为PRRSV2.6pg、CSFV43 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究4.8pg、SIV12pg（见图18）。-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.Dilutedat10；2.Dilutedat10；3.Dilutedat10；4.Dilutedat10；5.Dilutedat10；图18PRRSV，CSFV，SIV三重RT-PCR的敏感性试验Fig.18SensitivitytestofthemPCRforPRRSV,CSFVandSIV3.2.3特异性试验用已确定的六重PCR反应条件进行特异性试验，结果表明PEDV、PCV2、PPV模板均未扩增出条带，而PRRSV、CSFV、SIV模板均扩增出与目的片段大小相符的特异性条带（图19）。M:DL2000Marker;1:PRRSV,CSFV和SIVPCR产物;2-7:依次为PRRSV/CSFV/SIV/PEDVV/PCV2/PPV产物M:DL2000Marker;1:PCRproductsofPRRSV,CSFVandSIV;2-7:PCRproductsofPRRSV/CSFV/SIV/PEDVV/PCV2/PPV图19PRRSV，CSFV，SIV三重RT-PCR的特异性试验Fig.19SpecificitytestofthemRT-PCRforPRRSV,CSFVandSIV3.2.4多重RT-PCR对临床病料的检测44 贵州大学2015届硕士研究生学位论文36份临床病料检测结果表明，PRRSV感染阳性率为31%（11/36），CSFV感染阳性率为22%（8/36），SIV感染阳性率为39%（14/36）；二重感染阳性率达22%（8/36）；三重感染阳性率达8.3%（3/36）。结果与单项RT-PCR方法检测符合率为100%。4讨论近年来我国猪传染病流行的主要特征是：多病原混合感染，繁殖障碍性传染病和呼吸道传染病的普遍存在，特别是猪病毒性呼吸道疫病是目前我国规模化猪场的常发病、多发病，由于该病由多因素多病原引起，临床症状及病理变化似是而非，导致猪场在防治措施上难度加大，给我国养猪业带来极大的经济损失。目前，国内外发生的动物病毒病或一个症候群的疫病多同时涉及DNA和RNA两类病毒（方立等，2005）。由于DNA和RNA病毒基因提取过程和扩增过程均不相同，因此本实验通过对PCR条件的优化，分别建立了PRV、PCV2和PPV的3重PCR检测方法和PRRSV、CSFV和SIV的3重RT-PCR检测方法，实现了上述3种DNA病毒和3重RNA病毒的同时并同步检测，该方法可在一个反应体系中同时并同步检测上述DNA或RNA病毒，能快速、准确地对临床病料进检测，是一种实用、快速的检测方法，具有广阔的应用前景。在多重PCR反应中，引物设计至关重要，它是决定多重PCR成败的关键。本研究针对6种猪病病毒保守基因序列设计引物，以扩增PRVgB、PCVORF2、PRRSVORF6、CSFVC、PPVNS1、SIVM等部分基因片段，应用PrimerPremier6.0、Oligo7.4、MFEprimer和MPprimer软件进行综合分析，充分考虑PRVG+C含量较高而PPVG+C含量较低的问题，Tm值应该控制在50℃～60℃，确保在某一温度都能进行很好的PCR反应，尽量避免引物间非特异性扩增。笔者通过大量前期试验先确定单项PCR反应的最佳条件范围，为多重PCR反应选取了各自最佳反应条件的交集，最后获得最佳反应条件。前期工作保证了多重PCR常见的因引物之间交叉干扰而导致敏感性降低的缺点。敏感性试验结果表明，该多重PCR具有很强的敏感性，检测含量达到了pg级。近年来，猪病毒性疾病已严重危害世界规模化养猪业，我国许多规模化猪场均不同程度受到猪病毒性呼吸道疾病的威胁，疾病的发生和流行日益严重，发病率越来越高，猪群发生疾病时多种病原混合感染和继发感染的情况越来越普遍45 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究(王洪光等，2015)。杨增岐等（2006）实验结果表明PCV2与PRV混合感染率为21.7%；张明林等（2010）实验结果表明PRRSV与PPV双重感染率达l6.31％；王波等（2009）实验结果显示陕西省部分地区送检病料中普遍存在PRRSV与CSFV、PCV2、PRV的二重、三重甚至四重混合感染；蒙雪琼等（2006）实验结果表明检测的猪场分别存在SIV/PRRSV和SIV/PCV-2二重感染，SIV/PRRSV/PRV和SIV/PRRSV/CSFV三重感染。以上实验说明多病毒混合感染现象在全国猪场已普遍存在，因此快速、准确地诊断出发病原因对于及时并有针对性地对发病猪场采取药物治疗或免疫预防措施，对降低养猪生产中的疾病风险具有重要的现实意义。5结论（1）成功构建了PRV、PCV2、PPV等病毒的三重PCR的鉴别诊断方法；（2）成功构建了PRRSV、CSFV、SIV等病毒的三重RT-PCR的鉴别诊断方法；46 贵州大学2015届硕士研究生学位论文第四章六种猪呼吸道病毒多重PCR方法的建立及初步应用研究近年来，我国猪传染病主要表现为多病原混合感染，繁殖障碍性传染病和呼吸道传染病的普遍存的流行特征，特别是猪病毒性呼吸道疫病是目前我国规模化猪场的常发病和多发病，由于该病是由多因素多病原引起，表现的临床症状及病理变化有很大相似度，所以常见的病原学、血清学及分子生物学等病毒检测方法对几种病毒混合感染的诊断耗时较长，成本较高，不利于疾病的临床诊断和防制。因此，建立一种简便并能鉴定PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV六种病毒感染情况的早期快速诊断方法具有较大的应用价值。本研究根据该六种病毒保守基因序列，应用多重PCR引物设计系统Mpprimer、多因素引物特异性评估系统MFEprimer、DNAStar等软件设计引物并进行扩增条件的优化，建立了鉴别PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的六重PCR方法，以期为临床病料的快速准确检测、流行病学调查及疾病的防控和净化提供技术帮助。1材料1.1病毒见第二章1.11.2临床病料48份病料采自2015年贵州省不同地区养猪场的疑患呼吸道病毒性疫病的病死猪肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结等，每头猪的各种组织混合为1份病料。1.3主要试剂见第三章1.31.4主要实验仪器见第三章1.42方法2.1引物设计与合成见第二章2.12.2病毒核酸的提取按TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0说明书进行病毒核酸（DNA和RNA）的提取。47 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究2.3猪呼吸道病毒病四重PCR诊断方法的建立2.3.1猪呼吸道病毒病四重PCR反应2.3.1.1四重PCR反应体系的建立在PRV、PCV2、CSFV、SIV目的基因扩增结果的基础上，逐步确定4种病毒上下游引物（0.5µL、1µL、1.5µL、2µL），以确定最佳反应体系。2.3.1.2四重PCR反应条件的优化对四重PCR反应预设置8个梯度的退火温度（51℃、51.6℃、52.7℃、54.5℃、56.5℃、58.2℃、59.3、60℃）进行优化，以确定最佳退火温度。2.3.2四重PCR敏感性试验四重PCR反应的敏感性参照殷震和ElnnifroEM等（ElnnifroEMetal，2000）的方法进行。将提取的PRV、PCV2、CSFV、SIV病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，用灭菌三蒸水做10倍系列稀释，然后取每个稀释度的病毒模板分别进行PCR反应。2.3.3特异性试验分别以PRV、PCV2、CSFV、SIV、PPV、PRRSV核酸为模板进行四重PCR反应。2.3.4四重PCR对临床病料的检测利用已建立的四重PCR方法对收集于贵州省内的共48份临床病料进行检测，分别取病死猪混合病料反复冻融3次充分研磨后转入组织匀浆器中充分匀浆，于离心机中12000r/mim离心5min，各取200μL，参照DNA&RNA提取试剂盒说明书，按步骤提取病毒核酸（DNA和RNA），其余操作按照前述的方法进行。2.4猪呼吸道病毒病五重PCR诊断方法的建立2.4.1猪呼吸道病毒病五重PCR反应2.4.1.1五重PCR反应体系的建立在PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV目的基因扩增结果的基础上，逐步确定5种病毒上下游引物（0.5µL、1µL、1.5µL、2µL），以确定最佳反应体系。2.4.1.2五重PCR反应条件的优化对五重PCR反应预设置8个梯度的退火温度（51℃、51.6℃、52.7℃、54.5℃、56.5℃、58.2℃、59.3、60℃）进行优化，以确定最佳退火温度。48 贵州大学2015届硕士研究生学位论文2.4.2五重PCR敏感性试验五重PCR反应的敏感性参照殷震和ElnnifroEM等（ElnnifroEMetal，2000）的方法进行。将提取的PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，灭菌三蒸水做10倍系列稀释，然后取每个稀释度的病毒模板分别进行PCR反应。2.4.3特异性试验分别以PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV、PEDV、PPV核酸为模板进行五重PCR反应。2.4.4五重PCR对临床病料的检测利用已建立的五重PCR方法对收集于贵州省内的共48份临床病料进行检测，分别取病死猪混合病料反复冻融3次充分研磨后转入组织匀浆器中充分匀浆，于离心机中12000r/mim离心5min，各取200μL，参照DNA&RNA提取试剂盒说明书，按步骤提取病毒核酸（DNA和RNA），其余操作按照前述的方法进行。2.5猪呼吸道病毒病六重PCR诊断方法的建立2.5.1猪呼吸道病毒病六重PCR反应2.5.1.1六重PCR反应体系的建立在PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV目的基因扩增结果的基础上，逐步确定4种病毒上下游引物（0.5µL、1µL、1.5µL、2µL），确定最佳反应体系。2.5.1.2六重PCR反应条件的优化对六重PCR反应预设置8个梯度的退火温度（51℃、51.6℃、52.7℃、54.5℃、56.5℃、58.2℃、59.3、60℃）进行优化，以确定最佳退火温度。2.5.2六重PCR敏感性试验六重PCR反应的敏感性参照殷震和ElnnifroEM等（ElnnifroEMetal，2000）的方法进行。将提取的PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，用灭菌三蒸水做10倍系列稀释，然后取每个稀释度的病毒模板分别进行PCR反应。2.5.3特异性试验分别以PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV、PEDV、E.coli核酸为模板进行六重PCR反应。49 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究2.5.4六重PCR对临床病料的检测利用已建立的六重PCR方法对收集于贵州省内的共48份临床病料进行检测，分别取病死猪混合病料反复冻融3次充分研磨后转入组织匀浆器中充分匀浆，于离心机中12000r/mim离心5min，各取200μL，参照DNA&RNA提取试剂盒说明书，按步骤提取病毒核酸（DNA和RNA），其余操作按照前述的方法进行。3结果3.1猪呼吸道病毒病四重PCR诊断方法的建立3.1.1猪呼吸道病毒病四重PCR反应3.1.1.1多重PCR反应体系的建立通过对固定阳性样品模板改变引物浓度，确定最佳引物量。结果表明四重PCR反应在50μL反应体系中最佳反应条件为：上下游引物浓度PRV、PCV2各0.5μL、CSFV各1.0μL、SIV各1.5μL。当反应循环次数为35，退火温度56.5℃，多重PCR扩增效果最佳（见图20）。最佳反应程序：反应体系为50µL，其中2×1StepBuffer25µL；PrimeScriptOneStepEnzymeMix2μL；上下游引物PRV、PCV2各0.5µL；上下游引物CSFV各1µL；上下游引物SIV各1.5µL；模板PRV、PCV2、CSFV、SIV各1µLRNaseFreeH2O12µL。反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。优化扩增结果见图20。50 贵州大学2015届硕士研究生学位论文M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：51.6℃；3：52.7℃；4：54.5℃；5：56.5℃；6：58.2℃；7：59.3；8：60.0℃图20PRV，PCV2，CSFV，SIV四重PCR退火温度优化Fig.20TheoptimizationofannealingtemperatureofmPCRforPRV,PCV2,CSFVandSIV3.1.2敏感性试验在多重PCR反应中，各种病毒的最低检测量分别为PRV18pg、PCV22pg、CSFV48pg，SIV32pg(见图21)。-0-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；6.10稀释-0-1-2-3-4M:DL2000Marker;1.Dilutedat10;2.Dilutedat10;3.Dilutedat10;4.Dilutedat10;5.Dilutedat10;6.Diluted-5at10图21PRV，PCV2，CSFV，SIV四重PCR的敏感性试验Fig.21SensitivitytestofthemPCRforPRV,PCV2,CSFVandSIV3.1.3特异性试验用已确定的四重PCR反应条件进行特异性试验，结果表明PRRSV、PPV模板均未扩增出条带，而PRV、PCV2、CSFV和SIV模板均扩增出与目的片段大小相符的特异性条带（图22）。51 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究M:DL2000Marker;1:PRV,PCV2,CSFV和SIVPCR产物;2-7:PRV/PCV2/CSFV/SIV/PRRSV/PPVPCR产物M:DL2000Marker;1:PCRproductsofPRV,PCV2,CSFVandSIV;2-7:PCRproductsofPRV/PCV2/CSFV/SIV/PRRSV/PPV图22PRV，PCV2，CSFV，SIV四重PCR的特异性试验Fig.22SpecificitytestofthemPCRforPRV,PCV2,CSFVandSIV3.1.4多重PCR对临床病料的检测48份临床病料检测结果表明，PRV感染阳性率为13%（6/48），PCV2感染阳性率为42%（20/48），CSFV感染阳性率为21%（10/48），SIV感染阳性率为40%（19/48）；二重感染阳性率达23%（11/48）；三重感染阳性率达10%（5/48）；四重感染阳性率达2.1%（1/48）。结果与单项RT-PCR方法检测符合率为100%。3.2猪呼吸道病毒病五重PCR诊断方法的建立3.2.1猪呼吸道病毒病五重PCR反应3.2.1.1多重PCR反应体系的建立通过对固定阳性样品模板改变引物浓度，确定最佳引物量。结果表明五重PCR反应在50μL反应体系中最佳反应条件为：上下游引物浓度PRV、PCV2各0.5µL，PRRSV、CSFV各1μL，SIV各1.5μL。当反应循环次数为35，退火温度56.5℃，多重PCR扩增效果最佳（见图23）。最佳反应程序：反应体系为50µL，其中2×1StepBuffer25µL；PrimeScriptOneStepEnzymeMix2μL；上下游引物PRV、PCV2各0.5µL；上下游引物PRRSV、CSFV各1µL；上下游引物SIV各1.5µL；52 贵州大学2015届硕士研究生学位论文模板PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV各1µL；RNaseFreeH2O9µL。反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。优化扩增结果见图23。M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：51.6℃；3：52.7℃；4：54.5℃；5：56.5℃；6：58.2℃；7：59.3；8：60.0℃图23PRV，PCV2，PRRSV，CSFV，SIV五重PCR退火温度优化Fig.23TheoptimizationofannealingtemperatureofmPCRforPRV,PCV2,PRRSV,CSFVandSIV3.2.2敏感性试验在多重PCR反应中，各种病毒的最低检测量分别为PRV18pg、PCV22pg、PRRSV26pg、CSFV48pg、SIV32pg（见图24）。0-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；6.10稀释0-1-2-3-4M:DL2000Marker;1.Dilutedat10;2.Dilutedat10;3.Dilutedat10;4.Dilutedat10;5.Dilutedat10;6.Diluted-5at10图24PRV，PCV2，PRRSV，CSFV，SIV五重PCR的敏感性试验Fig.24SensitivitytestofthemPCRforPRV,PCV2,PRRSV,CSFVandSIV3.2.3特异性试验53 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究用已确定的五重PCR反应条件进行特异性试验，结果表明PEDV、PPV模板均未扩增出条带，而PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV模板均扩增出与目的片段大小相符的特异性条带（图25）。M:DL2000Marker;1:PRV,PCV2,PRRSV,CSF和SIVPCR产物;2-7:PRV/PCV2/PRRSV/CSFV/SIV/PPV/PEDVPCR产物M:DL2000Marker;1:PCRproductsofPRV,PCV2,PRRSV,CSFVandSIV;2-7:PCRproductsofPRV/PCV2/PRRSV/CSFV/SIV/PPV/PEDV图25PRV，PCV2，PRRSV，CSFV，SIV五重PCR的特异性试验Fig.25SpecificitytestofthemPCRforPRV,PCV2,PRRSV,CSFVandSIV3.2.4多重PCR对临床病料的检测48份临床病料检测结果表明，PRV感染阳性率为13%（6/48），PCV2感染阳性率为42%（20/48），PRRSV感染阳性率为38%（18/48），CSFV感染阳性率为21%（10/48），SIV感染阳性率为40%（19/48）；二重感染阳性率达31%（15/48）；三重感染阳性率达17%（8/48）；四重感染阳性率达6%（3/48），五重感染阳性率为0。结果与单项RT-PCR方法检测符合率为100%。3.3猪呼吸道病毒病六重PCR诊断方法的建立3.3.1猪呼吸道病毒病六重PCR反应3.3.1.1多重PCR反应体系的建立通过对固定阳性样品模板改变引物浓度，确定最佳引物量。结果表明六重PCR反应在50μL反应体系中最佳反应条件为：上下游引物浓度PRV、PCV2各0.5μL、PRRSV各0.8µL、CSFV各1.0μL、PPV各0.7µL、SIV各1.5μL。当反应循环次数为35，退火温度56.5℃多重PCR扩增效果最佳（见图26）。最佳反应程序：54 贵州大学2015届硕士研究生学位论文反应体系为50µL，其中2×1StepBuffer25µL；PrimeScriptOneStepEnzymeMix2μL；上下游引物PRV、PCV2各0.5µL；上下游引物PRRSV各0.8µL；上下游引物PPV各0.7µL；上下游引物CSFV各1µL；上下游引物SIV各1.5µL；模板PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV各1µLRNaseFreeH2O7µL。反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。优化扩增结果见图26。M：DL2000Marker；1：51.0℃；2：51.6℃；3：52.7℃；4：54.5℃；5：56.5℃；6：58.2℃；7：59.3；8：60.0℃图26PRV，PCV2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV六重PCR退火温度优化Fig.26TheoptimizationofannealingtemperatureofmPCRforPRV,PCV2,PRRSV,CSFV,PPVandSIV3.3.2敏感性试验在多重PCR反应中，各种病毒的最低检测量分别为PRV18pg、PCV22pg、PRRSV26pg、CSFV48pg、PPV86pg、SIV32pg(见图27)。55 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究0-1-2-3-4-5M:DL2000Marker；1.10稀释；2.10稀释；3.10稀释；4.10稀释；5.10稀释；6.10稀释0-1-2-3-4M:DL2000Marker;1.Dilutedat10;2.Dilutedat10;3.Dilutedat10;4.Dilutedat10;5.Dilutedat10;6.Diluted-5at10图27PRV，PCV2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV六重PCR的敏感性试验Fig.27SensitivitytestofthemPCRforPRV,PCV2,PRRSV,CSFV,PPVandSIV3.3.3特异性试验用已确定的六重PCR反应条件进行特异性试验，结果表明PEDV、E.coli、正常组织模板均未扩增出条带，而PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV模板均扩增出与目的片段大小相符的特异性条带（图28）。M:DL2000Marker;1:PRV,PCV2,PRRSV,CSF,PPV和SIVPCR产物;2-7:PRV/PCV2/PRRSV/CSFV/PPV/SIV/PEDV/E.coliPCR产物M:DL2000Marker;1:PCRproductsofPRV,PCV2,PRRSV,CSFV,PPVandSIV;2-7:PCRproductsofPRV/PCV2/PRRSV/CSFV/PPV/SIV/PEDV/E.coli图28PRV，PCV2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV六重PCR的特异性试验Fig.28SpecificitytestofthemPCRforPRV,PCV2,PRRSV,CSFV,PPVandSIV3.3.4多重PCR对临床病料的检测48份临床病料检测结果表明，PRV感染阳性率为13%（6/48），PCV2感染56 贵州大学2015届硕士研究生学位论文阳性率为42%（20/48），PRRSV感染阳性率为38%（18/48），CSFV感染阳性率为21%（10/48），PPV感染阳性率为8.3%（4/48），SIV感染阳性率为40%（19/48）；二重感染阳性率达31%（15/48）；三重感染阳性率达21%（10/48）；四重感染阳性率达6.3%（3/48）；五重感染阳性率达2.1%（1/48）；六重感染阳性率为0。结果与单项RT-PCR方法检测符合率为100%。3.4多重PCR试剂盒的组装3.4.1对照的制备3.4.1.1阳性对照按TaKaRa公司核酸提取试剂盒说明书分别提取PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV细胞培养物的核酸。采用PCR/RT-PCR分别扩增PRVgB基因、PCV2ORF2基因、PRRSVORF6基因、CSFVC基因、PPVNS1基因和SIVM基因。使用胶回收试剂盒分别回收扩增的条带，利用分光光度计测定回收的核酸的浓度。按照1:10的比例和pMD19-T载体进行连接反应，转化至Top10细胞，抗性筛选及PCR鉴定结果为阳性者，进行测序验证。将六种基因的阳性质粒等比例混合，分装每支50µL，浓度控制在80～100ng/µL。3.4.1.2阴性对照按TaKaRa公司核酸提取试剂盒说明书提取无PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV组织核酸，采用PCR/RT-PCR分别扩增提取的核酸并进行电泳检测。然后用无菌水稀释，分装每支50µL，将浓度控制在80～100ng/µL。3.4.2mPCRMix的制备2×1StepBuffer25.0µL；primerR1/F1（PRV）各0.5μL、primerR2/F2(PCV2)各0.5μL、primerR3/F3(PRRSV)各0.8µL、primerR4/F4(CSFV)各1.0μL、primerR5/F5(PPV)各0.7µL、primerR6/F6(SIV)各1.5μL；加RNAsefreewater至44µL。3.4.3试剂盒的成分及组装阳性对照、阴性对照各一支，mPCRMix20支(每支44µL)，PrimeScriptOneStepEnzymeMix一支放置于试剂盒的支架上，盖好盖子，做好标签，-20℃保存。3.4.4试剂盒操作说明3.4.4.1样品核酸提取按TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0说明书进行病毒57 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究核酸（DNA和RNA）的提取3.4.4.2mPCR扩增每份总体积50μL，取44μLPCR反应液（用前混匀），6μL模板核酸（DNAandRNA）。在PCR扩增仪上进行以下程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。3.4.4.3结果判定取5μLPCR产物及5μL阳性对照分别与1μL上样缓冲液混合均匀后，于2%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测（85V50min），紫外灯下观察结果。若出现192bp大小条带，则检测样品中含有PRV；若出现255bp大小条带，则检测样品中含有PCV2；若出现364bp大小条带，则检测样品中含有PRRV；若出现530bp大小条带，则检测样品中含有CSFV；若出现759bp大小条带，则检测样品中含有PPV；若出现981bp大小条带，则检测样品中含有SIV。若同时出现几条带，则检测样品中同时含相应的几种病毒，即表现为混合感染。4讨论现代养猪业已经逐步朝着规模化和集约化发展，但随着规模化和集约化程度的越来越高，猪群多病原引发的混合感染和继发感染情况也越来越普遍，猪病的复杂程度及其危害也与日俱增，猪传染病混合感染和继发感染的发生和流行成为制约养猪生产的重要因素（Ogawaetal，2009）。猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪流感病毒（SIV）等6种病毒是常见的猪病毒性呼吸道疾病病原，这些病毒感染猪群后往往出现相似的临床症状和病理变化，难以直观的进行判断，而多重PCR方法可以在同一反应体系中对几种病毒进行检测，能快速、准确地对临床病料进行诊断，有很大的应用前景（陈微晶，2008）。本实验通过条件优化，以及敏感性、特异性等实验。建立了PRV、PCV2、CSFV、SIV等病毒的四重PCR检测方法，PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV等病毒的五重PCR检测方法以及PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV等病毒的六重PCR检测方法，实现了上述几种病毒的同时并同步检测。目前，猪病毒性疾病已严重危害世界规模化养猪业，我国许多规模化猪场均不同程度受到猪病毒性呼吸道疾病的威胁，PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、58 贵州大学2015届硕士研究生学位论文SIV是主要的病毒性呼吸道疾病病原，同时都还可以不同程度地损伤机体免疫系统，降低机体对外界的抵抗能力，引起继发性混合感染，使得疾病的诊断难度越来越大，因此快速、准确地诊断出发病原因对于及时并有针对性地对发病猪场采取药物治疗或免疫预防措施，对降低养猪生产中的疾病风险具有重要的现实意义。而多重PCR方法恰能快速、准确地对混合感染的临床病料进行检测，而应疾病发展的混合感染越来越普遍这一特点，近些年来成功建立的针对不同病毒检测的多重PCR方法越来越多，方法也越来越完善。最初建立的多重PCR方法不是同一检测DNA病毒，就是同一检测RNA病毒，而对DNA病毒和RNA病毒混合感染的临床病料进行检测时，往往不能一步进行，需要将待检病料分为两份提取DNA和RNA，应用两种程序进行检测，随着研究的越来越深入，病毒核酸（DNA和RNA）可以同时提取，DNA和RNA病毒也可以应用同一程序进行快速检测，弥补了前者的不足（陈光达，2012）。赵朴等（2014）建立了能同时检测猪呼吸道疾病综合征常见病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型的四重PCR检测方法；刘志杰等（2012）成功建立了PRV、PCV2、PPV、PRRSV、CSFV和SIV六重PCR检测方法，能同时检测6种病毒（包括3种DNA病毒和3种RNA病毒）。5结论（1）成功构建了PRV、PCV2、CSFV、SIV等病毒的四重PCR鉴别诊断方法；（2）成功构建了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、SIV等病毒的五重PCR鉴别诊断方法；（3）成功构建了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV等病毒的六重PCR鉴别诊断方法；（4）组装了可进行临床使用的六重PCR鉴别诊断方法试剂盒，可区分PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV六种病毒的混合感染。59 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究主要参考文献1.于海．中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究[D]．2008，北京．2.方立，徐辉，陈伟杰，赵灵燕，倪柏锋，方维焕．猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立[J]．中国兽医科技，2005，35（12）：954-958．3.王波，张鹏，杨增岐，张淑霞，党如意，刘芳宁，黄建宁，樊荣，刘海生．陕西省PRRSV与CSFV、PCV2、PRV混合感染的检测[J]．河北农业学报，2009，18(5)：27-30．4.王丹丹，潘传毅．猪流感病毒的特性与流行研究进展[J]．饲料博览，2013(7)：44-46．5.王东东，邓雨修，招丽婵，李春梅，苏润环，徐贵娟，杨明柳，宋延华．我国猪繁殖与呼吸综合征流行概况[J]．动物医学进展，2009，30(5)：101-104．6.王宏魁，黄涛，苏惠龙，曹三杰．猪流感病毒研究进展[J]．河南农业科学，2011，40(12)：35-39．7.王洪光，李绍洪，汤德元，曾智勇，李春燕，郝飞，刘建，李达，韦冠东．PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用[J]．畜牧与兽医，2015，47(1)：5-8．8.王芳，袁海霞，傅衍．猪细小病毒分子生物学研究进展[J]．生物学杂志，2011，28(1)：82-84．9.王锡祯，王泽华．猪圆环病毒病的流行病学调查及其防治[J]．中国动物保健，2008（115）：52-55．10.王莹，任向阳，张昶，刘秋燕，王江辉，王川庆．猪瘟病毒分子生物学研究进展[J]．上海畜牧兽医通讯，2006(2)：8-11．11.王在时．猪细小病毒病及研究进展[J]中国兽医杂志，1990，16（5）：44-46．12.马静云，李浩波，王玲玲，何晓明，王连想，谢青梅，毕英佐．高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析[J]．中国兽医科学，2008，38(8)：650-657．13.白红光，卫广森，徐宏军．猪细小病毒分子生物学、诊断及核酸探针的研究进展[J]．饲料工业，2005，26（11）：53-56．14.白延杰．高、低致病性PRRSV的分离鉴定和二重RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用[J]．郑州，2009．15.孙艳明，赵德明．猪圆环病毒分子生物学研究进展[J]．中国畜牧兽医，2006，33(7)：62-64．16.华江．猪细小病毒病及其防控措施[J]．中国畜牧兽医文摘，2014，30(2)：89．60 贵州大学2015届硕士研究生学位论文17.李春华，王英，蒋凤英，胡建华．猪伪狂犬病研究进展[J]．动物医学进展，2008，29(3)：68-72．18.李华，杨汉春，郭玉璞．猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSv)感染的免疫学研究进展．中国兽医杂志，1999，25(9)：40-4219.李中兴，毛雪红．猪圆环病毒病的特点与防控[J]．中国动物保健，2013，15(2)：31-32．20.刘翠权．广西395个规模猪场猪呼吸道疾病综合征的病原学调查及防控措施[D]．南京：南京农业大学，2011．21.刘坤，兰邹然，姜平．猪瘟病毒分子生物学及检测技术研究进展[J]．动物医学进展，2012，33(10)：99-104．22.刘贤友．猪流感的流行特点和防控措施[J]．动物诊所，2013（10）：24．23.刘志杰，曾智勇，汤德元，周莉，梁海英，肖超能．猪繁殖障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的建立及应用[J]．畜牧兽医学报，2012，43（9）：1429-1436．24.吕翠，马小明，尹燕博，单虎．猪流感病毒研究进展[J]．动物医学进展，2008，29(11)：60-63．25.朱化鹏，张智鹏．猪瘟流行病学与防控措施[J]．畜禽业，2010(257)：8-9．26.闫亚景，魏广，师永刚，强慧勤，赵洪明，郝立宾．猪伪狂犬病的血清学调查报告[J]．今日畜牧兽医，2006(9)：23．27.余华．猪流感病毒分子生物学研究进展[J]．动物医学进展，2010，31(S)：208-212．28.余兴龙．猪瘟的流行病学与流行特点[J]．兽医导刊，2009(10)：27-29．29.来景辉，张堂田，范红结．猪圆环病毒分子生物学研究进展[J]．黑龙江畜牧兽医，2013（7）：24-27．30.孟潇，杨继杰，马福建．猪伪狂犬病的流行病学与诊断方法[J]．养殖技术，2012(5)：138．31.陈微晶．cDNA芯片技术检测猪呼吸道疾病综合征相关病毒方法的建立[D]．2008，黑龙江．32.吴国华，赵志荀，张强．猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学及免疫学的研究进展[J]．安徽农业科学，2010，38（13）：6716-6719．33.初小辉．吉林省猪伪狂犬病流行病学调查与防控措施的研究及应用[D]．长春：吉林大学，2012．34.张定姣，李坤，韦克林．伪狂犬病病毒分子生物学研究进展[J]．贵州畜牧兽医，2013，61 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究37（6）：17-19．35.张家恭．猪呼吸道疾病综合症的发病机理与防控措施[J]．养殖与饲料．2008，9：41-42．36.张靖飞．猪瘟病毒分子生物学研究进展[J]．中国兽医杂志，2002，38(4)：28-31．37.张明林，谢琴．宁夏猪场猪蓝耳病和细小病毒病的流行病学和血清学调查[J]．甘肃畜牧兽医，2010，40(1)：4-6．38.张伟，王承宇，杨松涛，高玉伟，夏咸柱．流感病毒的分子生物学研究进展[J]．中国比较医学杂志，2010，20(4)：74-79．39.张宇，曹三杰，文心田．猪细小病毒分子生物学研究进展[J]．贵州畜牧兽医，2005，29(6)：11-14．40.杨庆芳，宁官保．猪伪狂犬病的研究进展[J]．畜牧兽医科技信息，2010(7)：15-18．41.杨文超，张晓东．快速PCR研究进展[J]．中国生物工程杂志，2007，27(4)：99-103．42.杨增岐，杨泽晓，姜艳芬，祝卫国，王旭荣，史怀平．陕西省PCV2感染的血清学调查[J]．西北农林科技大学学报，2006，34(4)：1-4．43.周贺娟，王云龙，任瑞敏．流感病毒检测方法研究进展[J]．动物医学进展，2011，32(10)：90-93．44.单悦，高英杰，赵建增，付云云，郎广平，李勇，白雪，梅林，温涛，郭敏，杨举，罗胜军，邢海云，梁志选．猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究[J]．中国畜牧兽医，2012，39（4）：47-49．45.金冬日，张丽燕．猪伪狂犬病的研究进展[J]．畜牧兽医科技信息，2012，（11）：4-5．46.郭春红，董雅文，侯月梅．猪细小病毒病防控[J]．四川畜牧兽医，2011（3）：55-56．47.洪根，盛建华，周礼富．猪细小病毒病及其防治措施[J]．养殖技术顾问，2012(5)：110．48.侯喜林，甘孟侯，余丽芸．猪细小病毒分离、核酸探针研制及应用[J]．畜牧兽医学报，1998（5）：625-637．49.胡慧琼等，2004）胡慧琼，王红宁．猪细小病毒诊断与防制方法研究进展[J]．养猪，2004（1）：34-37．50.胡思科，肖淑敏，张桂红，廖明．猪圆环病毒Ⅱ型感染的免疫抑制机理研究进展[J]．动物医学进展，2006，27(9)：22-26．51.胡晓霞．三种主要犬呼吸道病毒多重PCR方法的建立和应用．武汉，2013．52.胡兴权，朱建军，丁玉春．猪瘟流行病学的研究进展[J]．畜禽业，2011(269)：48-50．53.娄忠子，李建强，李学瑞，柳纪省．猪圆环病毒的分子生物学研究进展[J]．中国兽医学报，2010，30（6）：862-868．62 贵州大学2015届硕士研究生学位论文54.赵蕾，管宇，李坤林，于新友，沈志强．伪狂犬病病毒分子生物学的研究进展[J]．中国兽医科学，2011，11（07）：765-770．55.钱如文．猪繁殖与呼吸综合征的发生与防制[J]．现代农业科技，2009，(14)：302，305．56.殷震，刘景华．动物病毒学[M〕．第二版．北京：科学出版社，1997，613-628．57.谢金文，苗立中，沈志强．猪流感在我国的流行现状[J]．养猪，2011(4)：89-92．58.谢俊岭，陈晓平，孟凡伟，等．一株新基因型猪圆环病毒Ⅱ型的鉴定[J]．中国农学通报，2013，29（11）：34-38．59.崔尚金，戚亭．猪细小病毒的分子生物学研究．猪业科学，2008(2)：22-24．60.鄂美聪．猪细小病毒病的特点与防治[J]．中国畜牧兽医文摘，2012，28(10)：176．61.董浩，李林，胡桂学．猪流感病毒的分子生物学研究进展[J]．黑龙江畜牧兽医，2011（7）：31-33．62.赖笑娴．细小病毒病的研究进展[J]．畜牧兽医科技信息，2010（6）：7-9．63.鲍伟华．猪圆环病毒感染的流行病学调查与控制[D]．2007，杭州．64.蒙雪琼，刘棋，陈义祥，黄夏，赵国明，黄胜斌，胡丽萍，陈芳芳．SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV交叉感染的检测[J]．动物医学进展，2006，27(11)：84-86．65.薛浩．猪细小病毒病及其防治[J]．中国畜牧兽医文摘，2013，29(9)：103．66.AllanGM,McehanB,ToddD.Anovelporcinecircovirusfrompigswithwastingdiseasesyndromes.VeterinaryRecord1998,142:467-469.67.Bellau-PujolS,VabretA,LegrandL,DinaJ,GouarinS,Petitjean-LecherbonnierJ,PozzettoB,GinevraC,FreymuthF.DevelopmentofthreemultiplexRT-PCRassaysforthedetectionof12respiratoryRNAviruses[J].JVirologicalMethods,2005,126(1-2):53–63.68.BrianM,MeNeillyF,ToddD.CharacterzationofnovelcircovirusDNAsassociatewithwastingsyndromesinpigs.JGenVirol,1998,79:217l-2179.69.BruschkeC.J.,HustM.M.,MoormannR.J.,vanRijnPA,vanOirschotJT..GlycoproteinERNSofpestivirusinducesapoptosisinlymphocytesofseveralspecies[J].J.Virol.1997,71:6692-6696.70.Carrere-KremerS,Montpellier-PalaC,CocquerelL,WychowskiC,PeninF,DubuissonJ.SubcellularlocalizationandtopologyoftheP7polypeptideofhehepatitisCvirus[J].JVirol.2002,76(8):3720-3730.71.CartwrightSF,LucasM,HuckRA.AsmallhaemagglutinatingporcineDNAvirus.I.63 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究Isolationandproperties[J].JCompPathol,1969,79(3):371-377.72.CLARKEG.Post-weaningmultisystemicwastingsyndrome[C]∥ProceedingsoftheAmericanAssociationofSwinePractitioners.Quebec,Canada,1997,28:499-501.73.CuiPS,ChaoZ,ChaoFZ,ShangJC.Detectionofporcineparvovirususingataqman-basedreal-timepcrwithprimersandprobedesignedfortheNS1gene[J].VirolJ,2010,7:353.74.ElbersK.,TautzP.,BecherD.,StollD,RümenapfT,ThielHJ.ProcessinginthepestivirusE2-NS2region:identificationofproteinp7andE2p7[J].J.Virol,1996,70:4131-413575.ElnnifroEM,AshshiAM,CooperRJ,KlapperPE..MultiplexPCR:Optimizationandapplicationindiagnosticvirology[J].ClincalMicrobiologyReviews,2000,4(13):559–570.76.FangY,KimDY,RoppS,SteenP,Christopher-HenningsJ,NelsonEA,RowlandRRHeterogeneityinnsp2ofEuropean-likeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirussisolatedintheUnitedStates[J].VirusRes,2004,100(2):229-235.77.FodorE,CrowM,MingayLJ,DengT,SharpsJ,FechterP,BrownleeGG.ASingleArminoAcidMutationinthePASubunitoftheInfluenzaVirusRNAPolymeraseInhibitsEndonucleolyticCleavageofCappedRNAs[J].JViro,2002,76:8989-9001.78.GormanO.T.,BeanW.J.,KawaokaY.,WebsterR.G.,EvolutionofthenucleoproteingeneofinfluenzaAvirus.JVirol1990,64:1487-1497.79.HanJ,LiuG.,WangY,FaabergKS.Identificationofnonessentialregionsofthensp2replicaseproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrainVR-2332forreplicationincellculture[J].JVirol,2007,81(18):9878-9890.80.HattaM.,AsanoY.,MasunagaK,ItoT,OkazakiK,ToyodaT,KawaokaY,IshihamaA,KidaH..MappingoffuctionaldomainsoninfluenzaAvirusRNApolymerasePB2moleculeusingmonoclonalantibodyes.ArchVirol2000,145:1947-1961.81.HayA.J.Thevirusgenomeanditsreplication.In“Textbook”ofinfluenza(Nicholson,K.G.Webster,R.G.,andHay,A.J.,Eds.)BlackwellScienceLtd.,London.1998:p43-53.82.ImmanuelLeifer,NicolasRuggli,SandraBlome.Approachestodefinetheviralgeneticbasisofclassicalswinefevervirusvirulence[J].Virology,2013(438):51-55.83.J.A.Ellis,A.Bratanich,E.G.Clark,G.Allan,B.Meehan,D.M.Haines,J.Harding,K.H.West,S.Krakowka,C.Konoby,L.Hassard,K.Martin,F.McNeilly.CoinfectionbyPorcineCircovirusesandPorcineParvovirusinPigswithNaturallyAcquiredPostweaning64 贵州大学2015届硕士研究生学位论文MultisystemicWastingSyndrome[J].JVetDiagnInvest,2000,12(1):21-27.84.KangSY,YunSI,ParkHS,ParkCK,ChoiHS,LeeYM.MolecularcharacterizationofPL97-1,thefirstKoreanisolateoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].VirusRes,2004,104(2):165-179.85.KeffaberK.ReProduetivefailureofunknownetiology.AmAssocSwinePractNewsl,1989,2:1-10.86.LailaDarwicha,EnricMateua.Immunologyofporcinecircovirustype2(PCV2)[J].VirusResearch,2012(164):61-67.87.LeeCS,MoonHJ,YangJS,ParkSJ,SongDS,KangBK,ParkBK..MultiplexPCRforthesimultaneousdetectionofpseudorabiesvirus,porcinecytomegalovirus,andporcinecircovirusinpigs[J].JVirolMethods,2007,139(1):39-43.88.LesterJ,HeidyD,MariaI,PatriciaD,MariaT.Firstreportofporcinecircovirustype2infectionsinCuba[J].ResVetSci,2010,88(3):528-530.89.LiuZB,GaoQR.ApplicationofMultiplexPCRtoStudiesonPlantBiology[J].MolecularPlantBreeding,2005,3(2):261-268.90.MaY,JiangYB,XiaoSB,FangLR,ChenHC.Co-expressedGP5porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscanformheterodimers[J].ActaMicrobiologicaSinica[J].2006,46(4):639-643.91.MankertzA,MankertzJ,WolfK.IdentificationofaProteinessentialforthereplicationofporcinecircovirus.JGenVirol1998;79:381-384.92.MappingoffuctionaldomainsoninfluenzaAvirusRNApolymerasePB2moleculeusingmonoclonalantibodyes.ArchVirol2000,145:1947-1961.93.MeehanB,CreelanJ,McNultyM.SequenceofporcinecircovirusDNA:affinitieswithplantcircoviruses.JGenVirol,1997,78:221-227.94.MeehanBM,McneillyF,ToddD,KennedyS,JewhurstVA,EllisJA,HassardLE,ClarkEG,HainesDM,AllanGM.CharacterizationofnovelcircovirusDNAsassociatedwithwastingsyndromesinpigs[J].JGenVirol,1998,79(9):2171-2179.95.MengXJ,PaulPS,HalburPG.Molecularcloningandnucleotidesequencingofthe3'-terminalgenomicRNAofthePorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JGenVirol,1994,75(7):1795-1801.65 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究96.MerijnVanhee,WanderVanBreedam,SarahCosters,MarcGeldhof,YtseNoppe,HansNauwynck.Characterizationofantigenicregionsintheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbytheuseofpeptide-specificserumantibodies[J].Vaccine，2011(29):4794-4804.97.MullisK,FaloonaF,ScharfS,SaikiR,HornG,ErlichH.SpecificenzymaticamplificationofDNAinvitro:thepolymerasechainreaction.ColdSpringHarborSymposiaQuantitativeBiology,1986,51:263-273.98.NawagitgulP,HarmsPA,MorozovI,ThackerBJ,SordenSD,LekcharoensukC,PaulPS.Modifiedindirectporcinecircovirus(PCV)type2-basedandrecombinantcapsidprotein(ORF2)-basedenzyme-linkedimmunosorbentassaysfordetectionofantibodiestoPCV[J].ClinDiagnLabImmunol,2002,9(1):33-40.99.NawagitgulP,MorozovI,BolinSR..Openreadingframe2ofPorcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein[J].JGenVirol,2000,81:2281-2287.100.OgawaH,TairaaO,HiraiT,TakeuchiH,NagaoA,IshikawaY,TuchiyaK,NunoyaT,UedaS..MultiplexPCRandmultiplexRT-PCRforinclusivedetectionofmajorswineDNAandRNAvirusesinpigswithmultipleinfections[J].JVirologicalMethods,2009,160(1-2):210-214.101.RohmC.,ZhouN.,SussJ.,MackenzieJ.,WebsterR.G.Characterizationofanovelinfluenzahemagglutinin,H15:criteriafordeterminationofinfluenzaAsubtypes.Virology,1996,217(2):508-516.102.RoyerRL,PorntippaN,PatrickG,etal.Susceptibilityofporcinecircovirustype2tocommercialandlaboratorydisinfection[J].JSwineHealthandProduction,2001,96(6):281-284.103.RuggliN,TratschinJD,SchweizerM,McCulloughKC,HofmannMA,SummerfieldA.Classicalswinefevervirusinterfereswithcellularantiviraldefense:evidenceforanovelprofunctionofN[J].JVirol.2003,77(13):7645-7654.104.SalichsM,SabatéD,HomedesJ.Efficacyofketoprofenadministeredindrinkingwateratalowdoseforthetreatmentofporcinerespiratorydiseasecomplex[J].JournalofAnimalScience,2013,91(9):4469-4475.105.ScholtissekC.Pigsas‘mixingvessels’forthecreationofnewpandemicinfluenzaAviruses66 贵州大学2015届硕士研究生学位论文[J].MedicalPrinciplesandPractice.1990,2(2):65-71.106.ShenHG,ZhouJY,ZhangX,etal.Interferenceofporcinecircovirustype2ORF2immunogenicitybyORF1andORF3mixedDNAimmunizationsinmice[J].Virology,2009,393(2):104-111.107.ShengC,XiaoM,GengX,LiuJ,WangY,GuF.CharacterizationofinteractionofclassicalswinefevervirusNS3helicasewith3’untranslatedregion[J].VirusRes,2007,129(1):43-53.108.SureshChandra,NeelamBisht.SWINEINFLUENZA[J].ApolloMedicine,2010,7(1):21-31.109.TicóG,SegalésJ,MartínezJ.Theblurredborderbetweenporcinecircovirustype2-systemicdiseaseandporcinerespiratorydiseasecomplex[J].VeterinaryMicrobiology,2013,163(3-4):242-247.110.TischerI,RaschR,TochtermannG.Characterizationofpapovavirusandpicornavirus-likepaniclesinpermanentpigkidneycelllines[J].ZentraiblBakteriolMikrobiolHygSerA,1974,226:153-167.111.TischerI,GelderblomH,VettermannW,KochMA.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA.Nature,1982,295:64-66.112.TischerI,BodeL,PetersD.Distributionofantibodiestoporcinecircovirusinswinepopulationsofdifferentbreedingfarms.ArchViol,1995,140(4):737-743.113.TruongC,MaheD,BlanchardP.IdentificationofanimmunorelevantORF2epitopefromPorcinecircovirustype3asaserologicalmarkerforexperimentalandnaturalinfection[J].ArchVirol,2001,146(6):1197-1211.114.WangY,ZhuZ,WangP,YuJ,WanL,ChenJ,XiaoM.CharacterisationofinteractionbetweenNS3andNS5BproteinofclassicalswinefevervirusbydeletionofterminalsequencesofNS5B[J].VirusRes,2011,156:98-106.115.WardA.C.,CastelliL.A.,LucantoniAC,WhiteJF,AzadAA,MacreadieIG.ExpressionandanalysisoftheNS2proteinofinfluenzaAvirus.ArchVirol1995,140:2067-2073.116.WissinkEH.,KroeseMV,vanWijkHA,RijsewijkFA,MeulenbergJJ,RottierPJ.Envelopeproteinrequirementsfortheassemblyofinfectiousvirionsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JVirol,2005,79(19):12495-12506.67 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究117.XuH,HongHX,ZhangYM,GuoKK,DengXM,YeGS,YangXY.CytopathiceffectofclassicalswinefevervirusNS3proteinonPK-15cells[J].Intervirology,2007,50(6):433-438.118.YasudaJ.,NakadaS,KatoA,ToyodaT,IshihamaA.MolecularassemblyofinfluenzavirusassociationoftheNS2proteinwithvirionmaxtrin.Virology1993,196:249-255.119.ZebedeeS.L.,LambR.A.InfluenzavirusM2protein:monoclonalantibodyrestrictionofvirusgrowthanddetectionofM2invirions.JVirol1989,62:2762-2772.120.ZhouL,ChenS,ZhangJ,ZengJ,GuoX,GeX,ZhangD,YangH.MolecularvariationanalysisofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinChina[J].VirusRes,2009,145(1):97-105.68 贵州大学2015届硕士研究生学位论文附录一攻读硕士学位期间参与发表的论文1．王洪光，李绍洪，汤德元，曾智勇，李春燕，李达，韦冠东．PRRSV、CSFV与SIV三重RT-PCR检测方法的建立[J]．畜牧与兽医，2015，47．2．王洪光，李绍洪，汤德元，曾智勇，李春燕，郝飞，刘建，李达，韦冠东．PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用[J]．畜牧与兽医，2015，47(1)：5-8．3．王洪光，郝飞，汤德元，张元鑫，马萍，罗险峰，曾智勇，刘霞，刘建，李达．伪狂犬病病毒gE基因DNA疫苗在动物体内诱导的免疫应答及IL-2对其作用影响的研究[J]．畜牧兽医学报，2014，45（9）：1488-1496．4．王洪光，汤德元，曾智勇，罗险峰，李春燕，郝飞，刘建，李达．规模化猪场主要细菌性疫病的流行病学调查[J]．畜牧与兽医，2014，46（9）：98-101．5．王洪光，汤德元，李春燕，曾智勇，刘建，郝飞，李达．贵州省某规模化猪场SIV和PCV-2感染的诊断[J]．黑龙江畜牧兽医，2014（8）：80-82．6．王洪光，袁方，汤德元，李春燕，曾智勇，刘建，郝飞，李达．贵州省某野生动物园黑熊魏氏梭菌病的诊断[J]．畜牧与兽医，2014，46（8）：127．7．王洪光，汤德元，李春燕，曾智勇，甘振磊，刘建，郝飞．梅花鹿暴发结核病的诊断[J]．畜牧与兽医，2014，46（7）：139．8．王洪光，李春燕，汤德元，甘振磊，陶玉顺，曾智勇，杨泽平，刘建，郝飞．中草药添加剂对青田田鱼的增重和免疫效果[J]．贵州农业科学，2014，42（7）：131-133．9．王洪光，郝飞，汤德元，王伟丞，李春燕，曾智勇，刘建．梅花鹿坏死杆菌病的诊治[J]．黑龙江畜牧兽医，2014，（4）：109-110．10．王洪光，汤德元，罗险峰，曾智勇，甘振磊，刘建，郝飞．贵州省某猪场PRRSV，PCV2和PRV混合感染的快速诊断[J]．黑龙江畜牧兽医，2013，（11）：108-110．11．王洪光，田芬，汤德元，李春燕，曾智勇，刘建，郝飞，李达．某规模化猪场几种病毒性疫病抗体水平及病原检测研究[J]．猪业科学，2014，31（9）：76-77．12．王洪光，汤德元，曾智勇，罗险峰，李春燕，郝飞，刘建，李达．猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立[J]．猪业科学，69 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究2014，31（8）：98-100．13．王洪光，田芬，汤德元，李春燕，曾智勇，郝飞，刘建，李达．某猪场仔猪暴发葡萄球菌病的诊治[J]．猪业科学，2014，31（2）：90-91．14．王洪光，汤德元，李春燕，曾智勇，罗险峰，甘振磊，刘建，郝飞．猪细胞因子IL-2、IL-4和IFN-y作为免疫增强剂和新型基因工程疫苗的研究[J]．猪业科学，2014，31（1）：99-101．15．王洪光，汤德元，李春燕，曾智勇，罗险峰，甘振磊，刘建，郝飞．规模化猪场主要细菌性疫病感染现象及综合防控措施研究[J]．饲料与畜牧，2013，（12）：13-18．16．王洪光，汤德元，罗险峰，曾智勇，李春燕，王凤，甘振磊，刘建，郝飞．猪瘟与其他疫病混合感染情况的研究进展[J]．中国猪业，2013，8（4）：56-58．17．王洪光，汤德元，曾智勇，李春燕，罗险峰，甘振磊，刘建，郝飞．某猪场猪流行性腹泻和传染性胃肠炎混合感染的诊断[J]．饲料与畜牧，2013，（04）：11-14．18．正在申请一“种快速鉴别猪呼吸道病毒性疫病的6重PCR检测方法”国家发明专利。70 贵州大学2015届硕士研究生学位论文附录二本文用到的部分英文缩写及含义说明英文缩略词表英文简称英文全称中文名称PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应mPCRMultiplePCR多重PCRPRVPseudorabiesvirus猪伪狂犬病毒PCVporcinecricovirus猪圆环病毒PRRSVporcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征syndromevirus病毒CSFVswinefevervirus猪瘟病毒PPVporcineparvovirus猪细小病毒SIVswinefluvirus猪流感病毒AmpAmpicillin氨苄青霉素DNADeoxyribonucleteicAcid脱氧核糖核酸dNTPDeoxynucleosideTriphosphate三磷酸脱氧核苷E.coliEscherichiacoli大肠杆菌EDTAEthylendiaminaetraaceticacid乙二胺四乙酸二钠IPTGIspropylthio-β-D-Galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷X-gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷bpbasepair碱基对kbKilobasepair千碱基对DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯ReversetranscriptionpolymerasechainRT-PCR反转录聚合酶链式反应reactionRNARibonucleteicAcid核糖核酸RNaseARibonucleaseA核糖核酸酶A71 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立与应用研究致谢本文是在导师汤德元教授的悉心指导和亲切关怀下完成的，研究生期间，导师从对我课题的设计到实验的探索给予了细致的规划和精细指导，同时花费了大量精力指导我完成论文的撰写；在3年学习期间不仅传授给我丰富的科学文化知识，增长了科学素养，而且教会了我许多做人的道理，树立了珍惜时光，勤奋学习，修身立德，立志成才的人生观。导师渊博的才识、严谨的治学态度、宽容的人生品格都使我获益匪浅，借此机会向汤老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢曾智勇教授在实验过程以及论文撰写方面给予我帮助，使我更轻松的解决遇到的问题，得以更快的提高自己！学习期间，得到了周碧君教授、王开功教授、文明教授等大力支持和帮助，在此向各位老师表示深深的感谢！同时对在百忙之中抽出时间评阅本论文的专家表示诚挚的谢意！感谢李春燕老师在我学习生活中给予了大力的支持和无私的关心；同时感谢刘建、郝飞等师兄的大力帮助，感谢本实验室王伟丞、李达、刘钊、韦冠东、代振江等同学对我提供的帮助，使我顺利的完成实验内容，充实了我的研究生生涯，在此向你们表示诚挚的谢意！衷心感谢我的父母和家人。他们给予我的经济以及精神上的支持和鼓励，使我在学习期间无后顾之忧，他们对我无私的爱与照顾是我不断前进的动力，感谢他们！衷心感谢所有关心、支持、帮助我的领导、老师、同学和朋友！王洪光2015年5月于贵州大学72 贵州大学2015届硕士研究生学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：2015年月关于学位论文使用授权的声明本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：导师签名：日期：2015年月73
此文档下载收益归作者所有
