下呼吸道病原菌多重降落pcr检测方法的建立与应用

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1、江苏大学硕士学位论文下呼吸道病原菌多重降落PCR检测方法的建立与应用姓名：罗欲承申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：邵世和20120607江苏大学硕士学位论文摘要目的：建立可于单一体系中同时直接检测下呼吸道标本中鲍曼不动杆菌(A嘲咖蚰c舫妇砌彻朋ff，A扫)、肺炎链球菌(跏印幻cDcc淞p删_『，lD以妇e，印)、b型流感嗜血杆菌(砌绷咖f蛔啦触d忆礁etⅥ)eb，Hib)与结核分枝杆菌复合群(坳妇c蛔．1姗lm沈rcH炳函complex，NITBC)的多重降落PCR检测方法。并应用临床标本与细菌培

2、养法比较验证所建立的多重降落PCR检测方法的灵敏度与特异性。方法：针对鲍曼不动杆菌b切oxAs1．1船基因、b型流感嗜血杆菌c印Ⅱ区、肺炎链球菌c础基因、Hibc口pⅡ区、结核分枝杆菌复合群插入序列Is们】D为靶标分别设计4对特异性引物，应用P血ne卜BIAST检测引物特异性；根据所设计的相关引物建立对应的单一PCR，并使用自纯培养菌株提取的基因组DNA验证其特异性与检测限；在所建立的单一PCR的甚础上建立多重降落PCR，对反应条件进行优化，使用标准菌株验证其检测限与特异性；进一步使用492份痰标本与细菌培养法

3、比较验证所建立的多重降落PCR检测方法的I临床灵敏度与特异性。结果：1．细菌培养：492份痰标本共培养出47份鲍曼不动杆菌、25份肺炎链球菌、7份b型流感嗜血杆菌、10份结核分枝杆菌复合群。2．单一PCR：所建立的鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群单一PCR分别于353bp、177bp、653bp、494bp处扩增出特异性条带，与其它菌株之间无非特异性扩增：相应的检测限分别为O．82pg、0．2pg(相当于0．2CFU)、6．3pg(相当于16CFU)、0．02pg(相当于8基因组拷

4、贝)。3．多重降落PCR：在单一PCR的基础上成功建立可同时检测鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群的多重降落PCR检测方法，其对鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、月rIi炎链球菌、结核分枝杆菌复合群的检测限分别为8．2pg、2pg(相当于2CFlJ)、63pg(相当于160CFU)、O．02pg(相当于8基因组拷贝)。4．临床标本验证：与细菌培养法相匕匕，所建立的多重降落PCR检测方法对492份痰标本中鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群的检测灵敏度达100％

5、，特异性分别达98％、94％、98％、98％。I下呼吸道病原菌多重降落PCR检测方法的建立与应用结论：成功建立了可于单管中同时检澳qI临床标本中鲍曼不动杆菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群的多重降落PCR检测方法，并经临床痰标本验证了其效能，证实其快速且具有高度特异性与灵敏度，有利于呼吸道感染性疾病的临床快速检测诊断及大规模流行病学研究。关键词：鲍曼不动杆菌，肺炎链球菌，b型流感嗜血杆菌，结核分枝杆菌复合群，多重降落PCRⅡ江苏大学硕士学位论文ABSTRACTObjectiVeTbestabl

6、ishamultiplextouchdowllPcR弱sayforstimulo憾detectionofAc伽e幻抚lc把r6口堋4口以以珥脚幻优l(：c淞p啊e“，∞n施e，胁d删f船啦触明朋e帅eb觚d岣，cD施c衙f删fM6伽M伽妇锄plexilloneh晚锄devaluateitspe咖nnonsb弱edoncultureusinlgcIinj∞IsputumsampIes．MethodsPrime璐ba∞d0n6肠oxA．51．1ikegene，∞诅gene，tlle陀舀0nⅡ0ftllecapsul

7、撕onloc嶙(c口p)，锄dtlleiIl∞nion∞quenceIS酗jDwercdesi印edforAc伽哟6口cfer6口瑚懈以以嵋脚幻c∞c淞p圮删妇岛胁鳓嘞f如岱啦触目l搬etypeb柚d肘-y∞施c厶们姗lm概H‰括C0mplex∞spectivelyweredesi弘ed觚deval岫tedbyPrirner-BLAsTforspecifici研siIl酉eplextoucM∞mPCRsb勰ed0nmedesi印edprime飓wereest{lblishedandeval眦dfortlleli

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