诺卡菌多重pcr及real-time pcr检测方法的建立

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEstablishmentofthemultiplePCRandTaqmanReal—timePCRmethodfordetectingNocardiaBy：WeigeSunSupervisor：AssociateProfessor．HaiyanYangProfessor．ZhenjunLiEpidemiologyandHealthStatisticsCollegeofPublicHealthMay,2014摘要学位论文原创性声

2、明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：殊眉歌日期：∞

3、I千年6月7日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文

4、的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：翻、渭歌日期：和I吁年6月?日摘要诺卡菌是一种机会致病茵，它弓{起的诺卡菌病可发生于许多人种、职业、年龄，主要引起肺部、皮肤感染以及急性或慢性化脓性或肉芽肿性病变，有时会侵袭脑部，形成脓肿，严重时甚至能够弓I起病人的死亡。研究人员通过大量的调查研究发现，诺卡菌感染病例正在逐年增加。诺卡菌的常规鉴定方法是分离

5、培养，需要花费大量的时间和入力，通常需要一至三周完成。随着分子生物学的发展，诺卡菌的PCR检测方法也得到了发展。多重PCR和Taqman探针RealtimePCR方法具有特异性好、灵敏度高，自动化程度高、速度快等优点，被广泛应用于微生物学检测。将这两种方法应用到诺卡菌的检测中，为快速分离和临床诊断诺卡氏菌提供一定的参考依据。目的本研究拟建立诺卡菌多重PCR及TaqManReal-timePCR的检测方法，为临床快速、准确鉴别诊断诺卡菌提供可靠的参考标准。方法l以诺卡菌的16SrRNA、rpoB、SecAl为靶基因，设计这三个基因的特异引物，

6、用诺卡菌标准株DSM43003、临床株CDC51的DNA为模板做单重PCR实验验证引物的特异性。在单重PCR反应的基础上优化多重PCR方法的反应条件和反应体系，同时对44株诺卡菌标准株、44株临床分离株和7株非诺卡氏菌株进行扩增，检验该方法的灵敏度、特异度和实用性。2基于诺卡菌rpoB基因设计TaqMan荧光定量PCR特异的引物与探针，提取鼻疽诺卡菌标准菌株DSM43003的DNA，扩增rpoB基因并纯化PCR产物，连接pMD一18T载体，导入JMl09感受态细胞，筛选阳性克隆子并提取质粒，10×倍比稀释所得质粒，制作标准曲线确定所建立方法

7、的检测下限；用29其他致病菌验证弓l物和探针的特异性；使用痰液模拟标本验证该方法的实际应用性。I摘要结果l利用单对弓l物对其中2株诺卡菌(DSM43003、CDCSl)进行扩增，出现的条带均为与目的片段长度一致的单一条带，经测序并经BLAST验证扩增的片段为目的基因。建立的多重PCR方法，44株诺卡菌标准株中有43株(97．7煳、44株临床分离株中有42株(95．5蚴3条片段都显示，7珠对照菌株均未显示条带。2建立诺卡茵TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线，确定该方法可以检测到23copy／ft．．应管目的基因，痰液模拟标本检测2．0×

8、102cfu／ml的细菌含量即可被检出；特异性实验中，只有诺卡菌有明显的S型扩增，且荧光信号强，其他菌株未见特异性扩增。结论I．研究建立的多重PCR、Taqman探针Real．timePCR能够快速、准确地鉴别诺卡菌，12小时内能完成对诺卡菌的检测，灵敏度高，特异性强，能够为快速鉴别诊断诺卡菌提供可靠的参考依据。2．多重PCR、Taqman探针Real-timePCR两种方法相对比，多重PCR的成本较低，且实验操作简单易掌握；而TaqmanReal-timePCR能够绝对定量地鉴别诺卡菌，灵敏度、特异度更好，敏感性也更强，2．O×10％f-

9、u／ml的诺卡菌即可被检出。关键词：诺卡菌多重PCRTaqMan荧光定量PCRAbstractNocardiaisanopportunisticpathogen，itcauses