《猪腺病毒多重pcr方法的建立及初步应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在指导老师指导下进行的研究王作及取得的研究，成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证一书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：参沖时间：又口化年知／可今关于论文使用授权的说明，本人完全了解湖南农业大学有关保留：学校有权保留、使用学位论文的规定即、送交论文的复印件和电子稿，可Ｗ采用影印缩印或扫描等，允许论文被查阅和借阅复制手段保存、、汇编学位论文。同意湖南农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表传播学位论文的全部或部分内容，并同意将由此产生的收益捐赠给学校教育基金会用于发展研究生教育。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）乃＾／文／研究生签名：泰今时间：７年月唯化之时间＜？导师签名；么日：奮巧乐年占丹 搁嬰摘要猪腺病毒是于１９６４年在英格兰首次被分离，此后，通过病毒分离和血清学调查逐步证明猪腺病毒在猪群中广泛存在。但是腺病毒作为自然感染病例病原体的重要性Ｗ及猪腺病毒的危害和造成的经济损失，迄今为止尚不完全清楚。目前对猪腺病毒的诊断手段有病毒分离、直接免疫巧光实验、琼脂免疫扩散试验、血凝，血凝抑制和病毒中和试验、分子生物学方法。病毒分离、直接免疫巧光实验这些诊断方法相对比较繁琐，花费的经费较多，检测时间长，无法方便快捷地对猪腺病毒进行大规模调查研究。目前国外和国内都有学者用分子生物学方法对猪腺病毒进行检测，不过ＰＣ艮至今未成一种快速为猪腺病毒的常规检测手段。本研究的目的是建立、简便、高灵敏度的猪腺病毒多重ＰＣＲ检测方法，为更好的了解猪腺病毒感染和传播提供技术手段。猪腺病毒多重ＰＣ民方法的建立：首先从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中下载四个血清型ＰＡＤＶ的基因序列，用ＤＮＡｓｔａｒ软件对下载序列进行同源性性分析，从不同血清型ＰＡＤＶ各Ｐ．０自的序列中找到型内比较保守但血清型之间存在变异的区域，用ｒｉｍｅｒ５软件进行引物设计。最后对ＰＣ民引物浓度、退火湿度进行优化，并进行敏感性和特异性分析。结果，４个血清型ＰＡＤＶ中，ＰＡＤＶ３和ＰＡＤＶ５在保守的六邻体部位分别设计了引物，ＰＡＤＶ－４１在基因０ＲＦ１５区域设计了引物，ＰＡＤＶ在Ｅ１Ｂ进行了引物设计。各引物浓’０．６ｕｍｏｌ、退火温度５５Ｃ时ＣＲ且通过对流行性腹泻病毒、传度在，多重Ｐ效果最佳；染性胃肠炎病毒、蓝耳病毒、杯状病毒、猪流感病毒、星状病毒的检测，发现该多重ＰＣ民方法具有很好的特异性。猪腺病毒多重ＰＣＲ方法的初步应用：采用建立的多重ＰＣ民方法对猪场收集的３１８份猪肛口拭子，８０份猪肺脏，１７３份猪鼻拭子，１８０份猪血清进行检测。结果肛口拭子．１血清的阳性率为１的ＰＡＤＶ检测阳性率为２０７５％０．４％．６６％，，鼻拭子的阳性率为，肺脏阳性率为７．５％。将检测到阳性样品的ＰＣＲ产物送公司进行基因测序分析同样证明，可Ｗ用于猪腺病毒的检测了建立的多重ＰＣ民方法具有很好的特异性，为猪腺病毒感染的调查和诊断提供了重要的技术支持。从检测结果发现在患病猪的感染率高于健康，猪在每个季节的感染率无明显差别，饲养环境差的猪场感染率高于饲养环境好的猪。关键词：猪腺病毒；多重ＰＣＲ；临床应用１ 湖南农业大学硕十（全日制专业硕±）学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＰｏｒｃｉ打ｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｗａｓｆｉｒｓｔｉｓｏｌａｔｅｄｉｎ１９６４ｉ打Ｅｎｌａｎｄａ打ｄｔｈｅｒｅａｆｔｅｒｉｔｗａｓｒｏｖｅｄｇ，，ｐｔｈａｔｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｗａｓｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｉｎ１：ｈｅｐｉｇｓｂｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｙｓｕｒｖｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒｈｉｆｅｃｌｏｓｓｅｓｙｔ：ｈｅａｒｍａｓａｎａｔｕｒａｌａｄｅｎｏｖｒｕｓｍｔｉｏ打ａｔｈｏｅ打ｓｉｔｓｅｃｏｎｏｍｉｃｐｇ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｏｆａｒｈａｓｎｏｔｆｕｌｂｅｅｎｕｎｄｔ．ｒｒｅｔｓｔｃｔｏｏｌｕｓｅｄｌｙｅｒｓｏｏｄＣｕｎｄｉａｇ打ｏｉｓｔｏ化Ｓｔｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｏｒｃｉｎｅｖｉｒｕｓｅｓｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｌｐ，ｇｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎｔｅｓｔ，ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ，ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｉｎＷｂｉｔｉｏｎａｎｄｖｉｒｕｓｎｅｕｔｒａｔｍｅ也ｏｄｓ．ｔｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏＶｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｄｉｒｅｃ，ｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｅｓｔｗｅｒｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｃｏｍｐｌｉｃａｋｄ，ａ打ｄｃｏｓｔｍｏｒｅｍｏｎｅｙａｎｄｔｉｍｅ，ａｎｄａｒｅｈａｒｄ－ｔｏｃｏｎｄｕｃｔｕｉｃｋｌａｎｄｅａｓｉｌａｌａｒｅｓｃａｌｅｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｔｒｅｓｅｎｔｑｙｙｇｐ，ｐｓｃｈｏｌａｒｓａｂｒｏａｄａ打ｄｄｏｍｅｓｔｉｃｄｅｔｅｃｔｔｈｉｓａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｕｓｉｎｇｐｏｒｃｉ打ｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｍｅ化ｏｄｓｂｕｔｔｈｉｓｈａｓ打ｏｔｂｅｃｏｍｅｒｏｕｔｉｎｅＰＧ民ｄｅｔｅｃｄｏ打ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅａｉｍｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｔｏ，ｙｍａｋｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎ化ｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｔｏｅｓ化ｂｌｉｓｈａｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｏｆｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．ｐＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣ民ａｓｓｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＦｉｒｓｔｆｉｎｄｉｎｐｇｔｈｅｆｏｕｒｓｅｒｏｔｙｐｅｓｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＰＡＤＶｏｎｔｈｅＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋａｎｄｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ，ａｎａｌｙｓｚｅｄｔｈｅｇｅ打ｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｂｙｔｈｅＤＮＡｓｔａｒｓｏｆｔｗａｒｅ，ａｎｄｇｏｔｔｈｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏＤｅｓｉ打ｉｎＰｉｍｅｒｏｆｆｒｓｅｒｔｅｂａｓｅｄｏ打ＣＯ打ｓｅｖｅｄｕｅ打ｃｅｓｗｉｔｈｓｏｆｔｗａｒｅｇｙ．ｇｇｒｏｕｙｐｓｒｓｅｑＰｒｉｍｅｒＳ．Ｏ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅＰＣ民ｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏ打，ａｎｎｅａｌｉｎｇ化ｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔａｎｄｓｅｄ巧ｃｉｔａｎａｌｓｉｓ．ＡｓａｒｅｓｕｌｔａＨｏｆｔｈｅｅｎｅｓｄｅｓｉｎｉｎｒｉｍｅｒｓｏｆＰＡＤＶ３ｙｐｙｙ，ｇ，ｇｇｐａｎｄＰＡＤＶ５ｉｎｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅａｒｔｓｏｆｔｈｅｈｅｘｏｎｄｅｓｉｎｉｎｒｉｍｅｒｓｏｆＰＡＤＶＩｅｎｅｎｅａｒｐ，ｇｇｐｇ＊－ＯＲＦｌ５ａｒｅａａ打ｄ化ａｔｏｆＰＡＤＶ４ｉｎＥｌＢ．Ｗｔ艮ｔｔｉｅｉｏｉｉｅｆｍｄｔｈｅｍｕｌｉｌｅｘＰＣｉｓｈｅｂｅｓｉ打，ｇｐ〇巨ａｃｈｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅ打ｔｒａｔｉｏｎｉｎ０．６ｕｍｏｌａｎｎｅａｌｉ打ａｔ５５ＣａｎｄｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｌｔｉｌｅｘＰＣ民ｐ，ｇ，ｐｍｅｔｈｏｄｈａｓｏｏｄｓｅｃｉｆｉｃｉｔｙｔｈｒｏｕｈｖｉｒｕｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰＥＤ八Ｖ、ＰＴＥＧＶ、ＰＲＲＳＶ、ｇｐｇＰＣＶ、ＰＩＶａｎｄＰＡＳＴＹ．ＴｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣ艮ｆｏｒｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｔｅｓｔｓｏｆ３１８ｓａｍｌｅｓｔｅｓｔｅｄｏｒｃｉｎｅａｎａｌｓｗａｂｓ８０ａｒｔｓｏｆｉｌｕｎｓｎａｓａｌｓｗａｂｓ１７３ｉｓｐｐ，ｐｇ，ｐ，ｐｇｇｔｔｔｔｔｔ１８０ｏｒｃｉｎｅｓｅｒｕｍｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｓｈｏｗｈａｔｈｅｏｓｉｔｉｖｅｒａｅｉｓ２０．７５％ａｎａｌｓｗａｂｓｈｅｏｓｉｉｖｅｐｐ，ｐ０〇ｒａｔｅｏｆ打ａｓａｌｓｗａｂｓｉｓ１０．４／０，ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆｐｏｒｃｉｎｅｉｓｓｅｒｕｍ１．６６／〇，ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆｕｎｏｓｉｔｉｖｅｗａｓＴｈｅｏｓｉｔｖｅｓａｍｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃ１；ｅｄｗｔｅｎｅｓｅｕｅｎｃｉｎａｎｄｔｈｅｌｇｐ７．ｐｉｐｉｈｇｑｇ，１１ Ａｂｓｔｒａｃｔｇｅｎｅｏ打ＮＣＢＩａｒｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｚｅｄｈａｓｇｏｏｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｄｂＵｉｔｙａｎｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｗｈｉｃｈｒｏｖｉｄｅｓｉｍｏｒｔａｎｔｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｕｏｒｔｆｏｒｔｈｅｐｐｐｐｉ打ｖｅｓｔｉａｔｉｏｎａ打ｄｄｔ．ｔｔｒｌｔｇｉａｇｎｏｓｉｓｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｉｏｎＦｒｏｍｈｅ化Ｓｅｓｕｓｆｏｕｎｄｉｎｄｉｓｅａｓｅｄｔｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｈａｎｈｅａｌｔｈｉｓｉｎｏｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｉｎ化ｅｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｅａｃｈｓｅａｓｏｎｐ呂ｐ呂，ｐｇｇｐ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇｅｎｖｉｒｏ打ｍｅｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ位ｒｍｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｈａｎｇｏｏｄｂｒｅｅｄｉｎｇｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．＾ＫｅｏｒｃｍｕｌｔＰｌｉ．ｗｏｒｄｓ：ｐｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｌｅｘＣＲｃｎｉｃａｌａｌｉｃａｔｉｏｎｙ；ｐ；ｐｐＩｌｌ 目录目录摘要ＩＡｂｓｔｒａｃｔＩＩ目录ＩＶ一第章１．猪腺病毒研究进展．前Ｓ１１．１１病原形态结构１１．２理化特性２１２．１．化学组成２１．２．２腺病毒的抵抗力３１．２．３腺病毒的肿瘤性３１．２．４腺病毒的转录和复制过程３１．３猪腺病毒的血清型３１．４病毒培养４１．５流行病学４１．５．１易感动物４．５２１．传染源５５．３１．传播途径５５５Ｉ．．４流行特点１．６临床症状６１．７致病机理６１．８病理变化７１．９诊断方法７１．９．１病原学方法７１．２８．９免疫学方法．．１９３分子生物学方法８１．１０．９４预防方法１．９．５腺病毒载体方面的研究进展１０１．１０．多重ＰＣＲ技术的发展与应用１１１１２．１１．本文研究的目的第二章．猪腺病毒多重ＰＣＲ方法的建立１３．１材料和方法１３１３１．１试验材料２１．主要试剂１３１．３主要仪器设备１３４１．病毒ＤＮＡ的提取和保存１３１．６ＰＣ艮方法的建立１５．７１７１多重ＰＣ民特异性试验．１８多重ＰＣＲ敏感性实验１７２領果１８２．１单重ＰＣ艮的扩増结果１８Ｉ －上湖南农业大学硕±（全日制专业硕）学位论文２．２单重ＰＣ民产物的鉴定结果１９２．３ＰＣ民多重方法的建立和优化结果１９２．４対论２３第Ｈ章．猪腺病毒多重ＰＣＲ方法的应用巧Ｌ材料和方法巧１．１样品的采集和处理巧．巧１２．相关试剂１．３．主要设备仪器２６１．４．病毒ＤＮＡ的提取和保存２６２．结果２６２丄对样品的检测结果分析２６２．２猪腺病毒在各地检测猪场的感染分布情况２７．２３猪腺病毒在所检测器官中的感染情况２８２巧．４猪腺病毒感染与季节的关系２．５猪腺病毒感染与仔猪年龄的关系２９２６３０．猪腺病毒感染与仔猪健康状况的关系２．７猪腺病毒的阳性病料的测序结果和分析３１２．８３４２．９结论３４参考：＾献３５麵３８作＃简Ａ３９ＩＩ 一章第．猪腺病毒研究进展第一章．猪腺病毒研究进展、，‘一一１？刖旨１［］１９５３年人腺病毒首次被分离到，在分离的过程中发现组织样品出现了细胞病变，后来的研究证明引起送种情况的原因是人腺病毒，不久在呼吸急促的病人的鼻腔拭子分离到该病毒，，甚，。之后在很多哺乳动物和禽类中分别分离到腺病毒至在海洋动物口－９比如海狮］２０、館鱼等样本中都分离到腺病毒，１３年也在海豚的腹泻粪便中分离到腺Ｗ病毒。腺病毒的命名是腺病毒主要存在于生物的腺体组织，于是就将该类型的病毒命名腺病毒。腺病毒在动物和人中分布比较广泛，致病情况大不相同。人感染腺病毒可Ｗ引起５一严重的肺炎和腹泻，特别是岁（＾１下的婴幼儿，在中国有段时间腺病毒引起的肺炎一造成婴幼儿很高的致病率和死亡率，腺病毒和人肾脏、肝脏、呼吸道和消化道的些疾病有联系，腺病毒对于各种动物的致病力有很大的。动物的腺病毒因为种属的不同不同。目前的研究来看狗、牛、海狮、狐狸、禽类等感染腺病毒后会引起严重的疾病如急性肝炎、急性肠炎、肺炎、脑炎；驴、马、猪、鼠、兔、録鱼等这些动物在感染腺病毒后没有明显的致病临床表现，大多数呈现隐性感染和无明显临床症状；腺病毒还会引起一些动物的恶性肿瘤。一１０］［猪腺病毒也于１９６４年在英格兰首次被分离到，送是只患有腹泻的小猪，第二一［１１］此后次腺病毒的分离是来自只患脑炎的小猪么中，经过Ｗ后的研究调查发现猪腺，２［１］病毒在世界各地广泛存在，例如中国、英国、美国、韩国、日本等均有相关报道。总的来看，，在世界各地很多地区的各类猪群都感染猪腺病毒英国某些地区竟然１３］５０［高达％，但是对于猪腺病毒的致病机理尚未完全清楚，对于是否将猪腺病毒作为一猪的种病原也未有完整的报道，尽管有很高的感染率，对于猪腺病并无防治的相关疫苗，也未对此引起足够的重视和关注，。同时由于该病只是隐性感染无法从临床方面发现明显的征兆和症状，所Ｗ必须借助实验室手段对此进行鉴定和诊断。因此本文将从病原、流行病学、临床症状、诊断Ｗ及防治，Ｗ期为科学诊断和预防控制该病的发生提供相关参考。１．１病原形态结构ｉ４ｉｓ截至目前ｔ，Ｌ猪腺病毒是属于腺病毒科哺，腺病毒分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒－現动物腺病毒属的成员。腺病毒没有囊膜，腺病毒核衣壳的直径为７０８０纳米，腺病１ 湖南农业大学硕上（全「Ｉ制专业硕±）学位论文一二一些类似于天线的纤突毒的形态是个十面体和。线状的双股ＤＮＡ被包于蛋白外壳即衣壳内。衣壳由２５２个壳粒组成，大部分由六邻体和小部分五邻体组成，其中六邻１体是病毒粒子内最大的蛋白质，约２化Ｄａ。五邻体位于二十面体的１２个顶上。五邻－体由宽约７ｎｍ的基部和由基部向外伸出的纤突组成。纤突直径为２纳米，长１１３２纳一—。纤突顶端为４纳米直径的球形物米因腺病毒的型的不同表现出不同的长度个，这是病毒感染细胞时结合于细胞受体的部分。猪腺病毒在感染细胞核内的病毒粒子经一常排列成结晶状。哺乳动物和禽类的腺病毒形态是样的，并无区别。腺病毒的形态－如图１１所示■六辑抹接衣壳９Ｉ二二—游＊巧图１－１腺病毒形态－ＡＦｉｇ．１１ｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｈａｐｅ１．２理化特性１．２．１化学组成６６Ａ的２〇ｘ？Ｘ￣哺乳动物腺病毒ＤＮ分子量为ｌ〇２５１０，病毒的Ｇ＋Ｃ含量为４８％６１％。３ＣｓＣ￣在ｌ中的浮密度为１．３２１．３５ｇ／ｃｍ。病毒粒子内的ＤＮＡ是环状和线状的ＤＮＡ卷曲粒子￣Ｅ４基因和晚期表达的与腺病毒。基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的Ｅ１－￣颗粒组装相关的Ｌ１Ｌ５基因。病毒粒子含有１０１４种蛋白质，其中有５种蛋白质的蛋２ 第一章猪腺病毒研究进展白含量在９０％Ｗ上，分别是分别为六邻粒，五邻粒基底及纤丝和两个内部蛋白（Ｖ和ＶＩＩ）。腺病毒的内部蛋白具有病毒特异性，相关机理目前的研究尚未解释清楚，可能是病毒感染后的一种新的蛋白。１．２．２腺病毒的抵抗力腺病毒相对比较稳定，对酸具有抵抗力，猪腺病毒在ｐＨ值为４时或者用氯仿、乙酪处理均稳定，所Ｗ在胃肠道中可Ｗ继续保持活性。比较耐热，室温下，能存活ｌＯｄＷ上。腺病毒没有脂质囊膜，所Ｗ丙爾、次氯酸钢／甲酸、酌制剂、乙醇和ＮａＯＨ都可将其杀死。１２．３腺病毒．的肿瘤性人腺病毒在实验室接种时对银齿类动物有致癌性，，但对于人类不表现致癌性目前为止没有发现在自然情况下腺病毒引起的人和动物肿瘤的临床病例，所Ｗ当前来说腺病毒作为疫苗载体是安全的，。腺病毒在接种新生的鼠类时会引起鼠的恶性肿瘤，一些就不会发生这种情况一不过等到小鼠稍大，般８日龄Ｗ上的小鼠就不会发生恶性肿瘤。１２．４腺．病毒的转录和复制过程腺病毒在细胞核内复制，按照转录的先后分为早期基因Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４，作用是１腺病毒ＤＮＡ的转录，ＤＮＡ的复制。、，宿主免疫抑制及抑制宿主细胞调亡晚期基因ＬＬ一２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５的作用是编码病毒的衣壳蛋白。各种腺病毒基因又可进步地分为一一更小的转录单位，如Ｅ１区可Ｗ进Ｅ１ＡＥ１Ｂ步分为和，每个转录单位都至少有个独特的启动子。１．３猪腺病毒的血清型ｉｗｓ５［］－３目前的研究来看共发现猪腺病毒的个血清型，日本分离鉴定了猪腺病毒１１９２０型紧密相关其中两个血清型［，］，在中国也报道过其中两个血清型并对其进行了部分２２２４［１测序猪腺病毒的各血清型之间的差异和区别经过了充分报道。血清型１型和３型在已知的序列同源性高达９６．３％，血清３型和血清５型已经测了全序列，３型公布的序列之间同源性高达９９．８％，５型公布的同源性是７６．８％，但是猪腺病毒与别的物种的－一１｜２５２８［，］腺病毒的同源性也比较低。猪腺病毒是于１９６４年在英格兰首次在只患有腹泻３ 湖南农业大学硕±（全日制专业硕±）学位论文一１＂Ｗ［１［的巧猪被分离的。第二次猪腺病毒的分离是来自只患有脑炎的猪脑么中。此后，，包括患有肺炎大量样品中分离到猪腺病毒、腹泻、肾炎和脑炎的样品。但是在健康猪的粪便中同样可Ｗ分离到猪腺病毒，并且大部分猪在感染腺病毒之后无临床症状。ＰＳ１。近些年来，猪，猪腺病毒和人腺病毒同源性島腺病毒被应用于表达载体和疫苗载体１－３血４型其中清型多在消化道Ｗ及肠道分离到。血清最为广泛，且能凝集多种动物一的红细胞，。般情况下断奶后的仔猪排毒最为频繁成年猪由于自身抗体从而排毒较少。猪腺病毒的３个毒株（Ａ、Ｂ、Ｃ）都属于腺病毒科哺乳动物病毒属。通过目［心Ｗ前的病毒中和实验，目前已发现至少５个血清型。血清１、２、３型属于Ａ株。血清４型属于Ｂ株。血清５型属于Ｃ株。１．４病毒培养绝大多数腺病毒的宿主是固定的，病毒对于本身宿主的细胞较为为敏感。所Ｗ腺病毒的分离培养过程中，通常应用宿主动物来源的原代（主要是肾、继代或传代细胞细胞，）。猪腺病毒比较容易培养猪腺病毒可Ｗ从粪便标本或鼻腔拭子或肺脏或肾脏的匀浆液中分离到，可在猪肾细胞，、猪胚睾丸等原代细胞培养繁殖也可在稳定的ＰＫ－１５细胞系中复制，并在接种病毒后盲传系带后才会发生腺病毒特征性的细胞病变。ｉｉ２９ｗ－［，，］１２４ｈ？５ｄ但是在传代适应后，可能缩短至８。在接种３之后，体外复制产生细胞病变效应（ＣＰＥ）。ＣＰＥｔＵ受感染细胞的肿胀、变圆、葡萄样的聚合，最终细胞将从基底脱落。腺病毒感染最有代表性的特征是包涵体在病毒的细胞核产生，包涵体的细胞核含有大量的晶体状病毒蛋白。这些核内包涵体可Ｗ在细胞培养的各组织中肾脏、远端空肠、盲肠的厥上皮、肺脏和实验过程直接感染的很多组织Ｗ及多个脏器中观察到。１．５流行病学１．５．１易感动物一Ｗ一腺病毒是常见的脊椎动物病原，第次发现是在人类体内发现。腺病毒的宿主一。般是固定的，个物种对于别的物种感染率低，对于自身是最为敏感的不过犬腺病Ｐ１］毒可Ｗ感染虎等猫科动物，高玉伟等人用血清学方法对老虎的流行病学调查发现犬口２］２型９．１７％，Ｌａｋａｔｏｓｌ等人腺病毒血清１型和犬腺病毒血清阳性率分别为２６．９％和通过流行病学调查发现腺病毒可Ｗ感染猫一种。犬传染性肝炎就是由犬腺病毒引起的４ 第一章猪腺摘毒研究进展急性，该病在世界各地均有分布，对犬类的健康造成很大的隐患。、高接触性传染病一种产蛋下降为特征的产蛋综合征禽腺病毒感染禽类会引起，主要表现为软壳蛋、崎形蛋增加，、褐色蛋壳颜色变浅。猪腺病毒的自然宿主只局限于猪不过人类腺病毒可Ｗ通过实验感染猪。在海洋哺乳动物中，海狮感染腺病毒会引发急性肝炎和严重的肠炎，海豚的腹泻也与腺病毒相关，館鱼感染腺病毒后并无明显的临床症状。１．５．２传染源腹泻的病猪和隐性感染的带毒猪是猪腺病毒比较常见的传染源。６０天Ｗ后仔猪在母源抗体逐渐中和减少后较易感染猪腺病毒，仔猪Ｗ粪便排毒最为普遍。成年猪抗体一，，，些体弱的成年猪也会检测到猪腺病毒水平高感染率低成年猪的排毒较为罕见。一猪腺病毒具体的参与协同的带菌者目前尚未清楚，步研究还需进。猪腺病毒相对比较稳定，所Ｗ非生物传播如护栏、食槽、衣服鞋子、运输工具和饲料都是感染源，饲一养员应注意清洁卫生不要在不同负责区域互相走动，这也是避免腺病毒进步传播的措施。１．５．３传播途径猪腺病毒的感染途径Ｗ消化道和呼吸道为主，带病的猪和隐性感染的猪在通过排泄物互相感染，也可Ｗ通过空气传播相互感染。母猪被感染后，病毒可Ｗ在胎儿组织中Ｖ复制，，Ｗ至母猪流产或者仔猪带毒。人腺病毒的传播途径是呼吸道和消化道眼睛分泌物和直接接触也是人腺病毒的传播途径。禽类腺病毒主要传播途径是受精卵垂直传播，并且水平传播如胃肠内容物、泄殖腔、咽粘膜也是禽类腺病毒的传播途径。在海、洋的哺乳动物通过海水传播腺病毒，在水族馆的海洋动物由于生存空间小接触频繁，所Ｗ更易感染。１．５．４流行特点绝大多数腺病毒的宿主是固定的一，对于猪腺病毒来说猪是目前已知的唯易感动Ｗ物，但是人腺病毒可Ｗ通过实验的方式感染猪只，犬腺病毒也可Ｗ感染猫科动物。一猪腺病毒的感染般无季节性，在环境恶劣，饲养条件变差时，猪身体状况变弱时感染率会提高。人腺病毒感染高发期是冬春季节。从流行病学调查发现大多数猪有腺病一般是亚临床的毒抗体，临床发病率较低，感染症状。猪腺病毒有参与混合感染的可３３［］能，猪腺病毒血清４型和猪肺炎支原体结合可Ｗ导致很严重的肺炎。该病在近期的５ 湖南农业乂学硕±（全Ｈ制专业硕±）学位论文研究相对较少，大多数研究是在２０世纪进行的，在世界很多国家的报道显示猪腺病毒［Ｗ？在当地发病率，其中猪腺病毒４型感染率达到２６％５３％。中国的黄伟江、陈琼等人在２００６年通过ＰＣＲ方法从送检的发病仔猪的呼吸道分泌物中扩增出猪腺病毒血清３型和５型，并对其进行的测序，这是猪腺病毒在中国的首次报道。１．６临床症状猪腺病毒自然条件下和实验室感染的猪通常表现为水样至糊状腹泻为特征的胃肠３？４道疾病。人工接毒的仔猪在ｄ后逐渐开始腹泻，毛色杂乱，精神沉郁，病程因个体１￣２的不同相差很大，，，腹泻周后陆续好转因接毒而死的仔猪极少大多数小猪能够恢复健康。人工接种猪腺病毒２型或猪腺病毒３型没有明显的临床症状，但将猪腺病毒血清１型进行人工接种可Ｗ引起腹湾症状，子宫内接种可引起妊娠母猪流产或者仔ｆｗｉ４猪带毒。仔猪在接种猪腺病毒血清型可引起肺炎。在患有脑炎的小猪脑中也分离到猪腺病毒，。脑炎、呼吸系统症状和流产症状在临床上比较少见猪腺病毒感染后Ｗ腹泻为主要临床症状。人类感染腺病毒后呼吸道，在中国、胃肠道、尿道和膀腕、眼、肝脏等均可感染一。腺病毒感染引起婴幼儿肺炎度非常流行，导致婴幼儿很高的致病率和死亡率禽类感染腺病毒后Ｗ发病突然和迅速死亡为特征，临床诊断表现为精神沉郁和粪便带血，羽毛杂乱污损。ｔＷ当海洋里的海狮感染腺病毒时会引起急性肝炎和比较严重的肠炎，海狮腺病毒一认为是致病病原的是海洋哺乳动物中目前己知的唯。在其他海洋哺现动物也会检测５口］到腺病毒，比如餘鱼。２０１３年腹泻的４头海豚排泄物检测到腺病毒，说明腺病毒跟Ｐｑ海豚的肠胃病有联系。１．７致病机理猪腺病毒通常与猪的胃肠疾病有关，也有关于生殖系统、呼吸系统和神经系统病症与猪腺病毒感染的报道，但是很少把猪腺病毒看作这些临床症状的主要病原。猪的腺病毒感染通过摄食或吸入发生。最初的复制发生在扁桃体和小肠末端的绒毛状肠细胞和琳己组织。所Ｗ在实验工程中，接种途径的不同不会影响病毒的复制，病毒的复制都在回脑的派伊尔结上或小肠绒毛覆盖的淋己组织上。？比如仔猪在口服接种猪腺病毒血清４型，接种后３５ｄ后发生水泻，持续到感染后－？的３６ｄ。猪腺病毒微粒存在于小肠内容物至接９天１１５ｄ之后，可Ｗ种后的第。接种６ 第一章猪腺病毒研究进展在猪的空肠末端绒毛检测到抗原，接种４５ｄ之后抗原在猪体内扩散开来仔猪在接２ＩＷ种后ｄ后引发腹泻，通过观察可Ｗ看到包涵体和抗原。１．８病理变化猪腺病毒感染猪么后并没有特殊的临床症状。被猪腺病毒感染的细胞常见的组织学上的损伤为绒毛状变钟和空肠和回肠末端肠细胞存在核内嗜碱包涵体，病毒的复制场所为空肠和回肠末端的肠细胞。自然感染的猪，通常感染的上皮细胞分布在派伊尔淋己集结附近的厥绒毛的侧面或者顶端或者纯绒毛的末端。这些肠细胞脱落，细胞核包含大量的嗜酸性的双嗜性包涵体，。实验接种感染的病例中包涵体常见于肺部和肾脏《３９ｉｆｗｉ偶尔见于脑部。研究发现通过脑部接种时可Ｗ诱发脑炎；口或鼻接种会引起非化２？胳性脑炎。核内包涵体可Ｗ见于猪的各个器官中，特别是肺、肾和脑。在接种３周后这些组织中可Ｗ分离到猪腺病毒。间质性肾炎见于自然感染腺病毒的猪。肾脏损伤包括炎症和髓质小管细胞系的核内包涵体。通过分离病毒、电子显微镜和ＦＡ染色可Ｗ判断是否感染腺病毒１．９诊断方法猪腺病毒感染猪之后并没有特有的临床症状，经鉴定确诊是否为腺病毒感染主要还，所用方法主要包括病毒分离是需要接种实验室手段来诊断、直接免疫巧光实验、琼脂免疫扩散试验、血凝抑制和病毒中和试验、分子生物学方法，Ｗ上方法各自有优缺点。１１．９．病原学方法１．９丄１样品采集和处理一采集的样品般为粪便样品０．２５％水解乳白蛋、鼻腔式子、肠或肛口拭子等。用’＇ａｎｋｓ８－２０白Ｈ氏液做倍稀释后，Ｃｌ＾下妥善保存。猪腺病毒，加入青霉素、链霉素在猪身体内分布很广，在消化道和呼吸道很多器官均可检测到腺病毒，但是猪腺病毒粪便排毒较为普遍常见，按照Ｗ往的检测结果粪便检出率较高。样品处理：在病毒分离。：前对样品进行妥善预处理，可Ｗ达到事半功倍的效果组织病料剪碎研磨制成１１〇乳剂，冻融４次５０００ｒｍ离也２０ｍｉｎ，／ｍ后，完，再吸取上清液用微孔滤膜进行过滤除菌°－２０Ｃ冰－８ＴＣ妥善冻成后置于箱保存后备用。粪便样品Ｗ及肛口拭子经过离也和灭菌后（［巧存。７ 湖南农业大学硕北）（全口制专业硕±学位论文１９丄２．病毒分离鉴定腺病毒的宿主相对比较固定，，猪腺病毒对于猪的细胞比较敏感可Ｗ选用猪原代一６口，２７’４１］－细胞来培养繁殖，般用ＰＫ１５。加入１．５％的胎牛血清和１０（）１１１／１１１１＾青霉素、１００＾ｉｇ／ｍＬ链霉素的ＭＥＭ营养液，３７＾静止培养。第二天观察细胞是否有特征性细胞病变（ＣＰＥ），继续培养两周。观察到体外复制产生细胞病变效应（ＣＰＥ）。Ｃ阳是指细胞在感染腺病毒后发生肿胀、变圆、葡萄样的聚合等现象，最终细胞会从培养基基底脱落，。腺病毒感染的最有代表性的特征是包涵体在病毒的细胞核内产生包涵体的细胞核里含有大量的晶体状病毒蛋白。可１＾用电镜进行观察，这些核内包涵体可Ｗ在细胞培养的各组织中如肾脏、远端空肠、盲肠的肠上皮、膀脏和实验过程直接感染一些组织和器官中观察到的。１．９．２免疫学方法Ｉ９．２１．．直接免疫巧光法一直接免疫巧光法已经使用了几十年，是、有效的检测方法，操作简洁种简单、方便，，、快捷和特异性强能够有效区分种群间病毒的属但是并不能对其进行分型。一４２［］该方法常规都是用来检测，也有些人将该方法引入疫苗生产的过程。１．．２．９２：琼脂免疫扩散法一琼脂免疫扩散试验和直接免疫焚光法样只能区分种群间病毒的属，不能对其进行分型。目前琼脂免疫扩散试验广泛用于检测病毒抗原，用于检测血清抗体情况较少。一一由于该方法成本低，些规模较小的、操作流程简单，是个方便而经济检查手段在一养殖场、试验条件差的实验室是种适用的方法。１．９．２３血凝、血凝抑制和中和试验＂＂猪腺病毒１型能凝集大鼠、豚鼠、猴和人０型红细胞，４型凝集大鼠和鸡红细胞，２和３型则无血凝性。用这个方法可Ｗ克服琼脂免疫扩散法和直接免疫巧光法的不能区分血清型的缺陷。１９．３分．子生物学方法免疫学方法虽然可Ｗ对腺病毒进行鉴定，但是对于大规模的检测，不能及时对于一些流行情况进行了解和分析。ＰＣＲ技术己经广泛运用于很多领域，被运用于腺病毒一＂１［］Ｐ］ＰＣ民的诊断。黄伟江、陈琼等用套式的方法对送检的病料进行检测，第次在中８ 第一章猪腺病毒研究进展国报道关于猪腺病毒在中国的感染。通过测序确定了猪呼吸道存在猪腺病毒的感染。４４【］２００９年，Ｈｕｎｄｅｓａ等等运用定量民Ｃ民对猪排泄物、生活污水和湖水样品进行猪腺病毒检测，为猪腺病毒的检测提供新的思路。不过迄今为止，ＰＣ民还未作为临床样品检测的常规诊断方法，最主要的原因是目前只用ＰＣＲ方法检测出血清３型和５型。本文建立血清１３４５型的多重ＰＣ民方法，用快速便捷的方法迅，，，速检测出临床样品中猪腺病毒的血清型，为猪腺病毒的临床研究提供便捷经济的手段。Ｉ．９．３．１分子生物学方法的分类核酸探针的检测技术：核酸探针检测技术创建于１９６８年，其原理是核酸杂交，用带有同位数标记或者其他标记的ＤＮＡ或者ＲＮＡ来检测病原微生物中核昔酸序列。可将核酸探针分为基因组ＤＮＡ探针、ｃＤＮＡ探针、ＲＮＡ探针和人工合成的寡核巧酸探针等几类，，。目前核酸探针应用比较广泛主要用于检测临床标本中病原微生物Ｗ诊断病毒、细菌等疾病，并且在检测生物体内抗生素的耐药性、流行病学调查、恶性肿瘤、遗传病、法医学鉴定、食品工程、环境工程等方面也有广泛运用。核酸探针有价一格昂贵，制备过程复杂，实验要求较高等这些缺点，需要进步创新和改进。ＰＣ民检测技术：自ＰＣ民技术１９８５年问世Ｗ来，广泛应用于环境、生物、医学、食品、刑事侦查、疾病预防、营养健康等等很多领域，逐渐显示出其强大的功能性和一技术性，，随着常规ＰＣＲ方法的使用些比如递减ＰＣＲ、实时炎光定量ＰＣＲ、套式ＰＣＲ、逆转录ＰＣ民等等也相继出现。ｉＬＡＭＰ一技术：ＬＡＭＰ技术叫环介导等温扩增技术，是２０００年开发出的种新型核酸扩增技术，利用具有链置换，该技术通过帮基因的６个特定区域设计４条特异引物一９１０－活性的ＤＮＡ聚合酶在恒温条件下反应个小时，就可Ｗ将靴基因扩増１〇１〇倍。可Ｗ直接用肉眼观察、凝胶电泳成像或者浊度仪直接判断反应结果，该方法有操作方便、检测快速、设备要求低、高度灵敏性及特异性强等方面的优势，适合在简单实验室大量进行相关病原微生物的检测。基因芯片检测技术，：基因芯片技术是生物学与电子学的完美结合基因芯片技术的原理是基因芯片表面的固定位置排列着可识别的探针序列，采用核酸分子碱基配对的原则相互识别，经过分析处理巧片的杂交图像，可Ｗ对检测样品中的基因序列的信息进行分析一。基因芯片技术将Ｗ前很复杂的步骤集中在个很小的芯片上，全程实现自动化，该技术的发展和运用使检测效率成大数量级增加，节约实验经费和实验人员９ 湖南农业乂学顿｜：：（全日制专业硕±）学位论文，的精力，减少实验步骤，减少实验过程中人为造成的误差可１＾＾对检测的生物样品的基因序列和表达信息进行分析，可Ｗ对其进巧定性和定量的相关研究。１．９．４预防方法至今对于腺病毒尚无特效治巧药物一，关于人类和禽类研发出些弱毒苗和灭活苗，一由于猪腺病毒对于猪的危害不是很明显，般都是亚临床症状，不过猪腺病毒作为载体广泛应用于基因治疗和基因疫苗。对于猪腺病毒的防治主要是加强管理、增强猪群体质一、减少应激、做好卫生工作等些管理方面的努力１．９．５腺病毒载体方面的研究进展随着分子生物学技术的日益更新和迅猛发展，得益于重组ＤＮＡ方法的开发与建立，使腺病毒病毒被用作载体提供了技术可能。开发得比较成熟的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒一、瘤病毒好痘苗病毒等。其中腺病毒载体属于开发比较成熟的种基因载体。一腺病毒载体目前已经成为基因治疗和重组疫苗研究等方面的常规病毒载体，是种一Ｅ有效、稳定的优良载体，目前腺病毒己经发展到了第３代。第代腺病毒载体是指１或者Ｅ３基因，此类载体在未经纯化可引发机体的炎症和免疫反应，纯化后可Ｗ安全使用，体内表达周期可达４周；第二代腺病毒载体是Ｅ１和Ｅ３基因缺失的情况下缺失Ｅ一２和（或）Ｅ４基因，在免疫反应Ｗ及安全性方面作了些改良，但是由于制备困难、过程繁琐，目前应用不是很广泛：第Ｈ代腺病毒载体缺失了全部的或大部分腺病毒基，ＩＴ民。３５ｋｂ因仅可保留和包装信号序列第兰代腺病毒载体最火可插入的基因，病毒一蛋白表达引起的细胞免疫反应进步减少，载体中引入核基质附着区基因可使得外源一一基因保持长期表达，并增加了载体的稳定性。这载体系统需要个腺病毒突变体作为辅助病毒一些固定的位置插入外源性基因。腺病毒的优势是可Ｗ在够在不影响，能病毒复制的情况下让外源性基因得到很好的表达，腺病毒在活疫苗应用上也比较活跃。腺病毒宿主范围广泛。由于人腺病毒和动物腺病毒基因相似度很高，对人体的低致病性、病毒颗粒比较稳定、基因较少发生重排，动物腺病毒的研究得到人们的重视，动物腺病毒载体是目前最有前景和潜力的载体之一。动物腺病毒比如牛、猴、猪、鼠、犬、兔和禽类等腺病毒进行了深入的研究，同时也取得了很多突破性进展：比如表达人类病原方面，ＨＩＶ、ＳＡ民Ｓ、ＥＢＯＬＡＶｉｒｕｓ等重组腺病毒的成功构建，并在猴、鼠、１０ 第一章猪腺病毒研究巧展雪貂、犬等多种动物模型中利用，其免疫产生的强烈体液免疫和细胞免疫能够抵抗相应病原，表现出良好的保护作用腺病毒载体能够高效、良好地表达外源性基因，并且可Ｗ对外源蛋白进行剪切和加工，表达的蛋白具有天然蛋白的特性，能够用于疫苗研发、药物研发及肿瘤治疗等多个领域，已经表现出良好的前景和巨大的潜力，不仅在人腺病毒方面有研究和开发，而且动物腺病毒载体的开发对人和动物的疫苗和疾病控制方面发挥越来越重要的作用。腺病毒载体在临床应用过程中的缺陷是腺病毒表达的时候病毒蛋白质引起的宿主反应，容易造成感染细胞丢失，外源基因表达短暂等这些情况，因此现在研究的目标是降低重组腺病毒载体产生的集体抗原特异性免疫反应。在癌症治疗方面，腺病毒载体被广泛用于癌症治疗放化疗，可Ｗ提高早期癌症患者的治愈率，减少晚期癌症患者的疼痛，目前腺病毒载体由于技术方面的限制，无法实行量产，价格相对昂贵，程序比较复杂，不能大规模运用于普通人的临床治疗，相信不久的将来解决技术的壁垒，让腺病毒载体运用于更加广泛的基因治疗，目前腺病毒载体是目前最有前景的病毒载一体之。目前我国很多方面的条件不是特别完善，临床应用方面与西方发达国家尚有一些差距，，需要从技术层面提高水平要尽快从实验室试验阶段转变到成熟的临床应用，加强免疫途径和程序Ｗ及安全评价等方面进行更加全面深入的研究和学习。猪腺病毒通常引起较为温和的疾病，造成的经济损失小，所Ｗ猪腺病毒疫苗没有进行商业化生产。目前主要腺病毒疫苗的研究方向在人腺病毒和禽腺病毒，猪腺病毒主要作为载体用于其他物种的基因导入和蛋白的表达，例如猪腺病毒３型己经作为载体在临床试验中得到了广泛应用。目前使用复制缺陷型腺病毒载体也比较常见，相比原先的复制型腺病毒载体，载，前者安全性更高体自身免疫原性大大降低。例如将猪伪狂犬病毒保护性抗原基因的复制缺陷腺病毒临床应用于新生的仔猪，实验证明既能产生有效得抗体，也能不受母源抗体的影响，对仔猪的保护达到４个月之久。１．１０．多重ＰＣＲ技术的发展与应用自？０１技术１９８５年问世１＾来，随着这么多年来的发展，？（：民广泛应用于环境、生物，、医学、食品、刑事侦查、疾病预防、营养健康等等很多领域逐渐显示出其强一些比如递减ＰＣＲ大的功能性和技术性，随着常规ＰＣ民方法的使用、实时炎光定量，ＰＣＲ、套式ＰＣＲ、逆转录ＰＣＲ等等。１１ 湖南农业火学硕±（全ｕ制专业硕」：）学化论文一在实际临床使用过程中，需要处理大量材料和检测项目，人们希望找出种特异性高、灵敏度高、高效、简单便捷和经济的方法，于是多重ＰＣ民方法应运而生。多ＰＣ民技术主要针对多一重种病原微生物或者多个基因的同时鉴定检测，是在同个反应４９民［］ＰＣＲ体系中加入多种特异性引物进行ＰＣ扩增的生物学检测手段。多重技术的出一一，掀起了临床检测技术的次新的革命，该技术被公认为种快速现、方便、准确的鉴别多种病原混合感染的诊断方法。多重ＰＣＲ方法自身的优势决定了其极高的临床价值，其潜力有待开发，有着广阔而积极的前景。多重ＰＣ民反应体系中存在多对引物，所Ｗ多重ＰＣ民设计引物时需要考虑多方面的因素，引物设计的成功与否决定着多重ＰＣ民方法建立的是否成功一。多重ＰＣ民另外个重要因素是反应体系的调整，反应体系的调整使多重ＰＣ民扩增效率提高，提高检测方法的灵敏度，使多重ＰＣＲ方法这到最好效果。１．１１．本文研究的目的，猪腺病在猪群中的感染率相对较高目前对猪腺病毒的研究相对较少，英国某些地区高达５３％。我们目前对猪腺病毒的诊断手段主要为电子显微镜观察、感染细胞的免疫巧光、免疫组织化学染色检测病毒抗原检测、血凝中和实验、琼脂免疫扩散实验。这些手段价格昂贵，步骤相对繁琐，国内外都有学者用ＰＣＲ方法对猪腺病毒进行检测，不过迄今为止，ＰＣ艮还未作为临床样品检测的常规诊断方法，最主的原因是目前只用ＰＣ艮方法检测出血清３型和５型。本文建立血清１，３，４，５型的多重ＰＣ民方法，用快速便捷的方法迅速检测出临床样品中猪腺病毒的血清型，为猪腺病毒的临床研究提供便捷经济的手段，还可此方法做相关地区的流行病学调查，，使大规模检测成为可能一为进步研究腺病毒流行情况作技术上的有力支撑。１２ 二章ＰＣＲ第．巧腺巧窜多重方法的座立第二章．猪滕病毒多重ＰＣＲ方法的建立１．材料和方法１．１试验材料一一采集了些样品和实验室的些送检样品，其中来自湖南、江西、江苏的猪肛口拭子，来自湖南，、江西、江苏的各年龄层猪鼻腔拭子来自本实验室的粪便送检病料和肺部送检病料，，。猪腺病毒在肠道中排毒最为常见所Ｗ重点检测猪肛口拭子猪腺病毒在呼吸症状的猪也会检测到，所Ｗ重点检测猪肛口拭子和猪鼻腔拭子。１．２主要试剂裂解液、醋酸钢、琼脂糖、无水乙醇、Ｔｒｉｓ饱和龄、蛋白酶Ｋ和无水乙醇为国产分析纯；即用型ＰＣ民试剂念３．０、ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自ＴａＫａＲａ公司；ＰＣ民引物由华大基因公司合成＾；１．３主要仪器设备‘－２０Ｃ冰箱－、８（ＴＣ冰箱、超净工作台、高速冷冻离也机、精密电子天平、凝胶成像系统、琼脂糖电泳槽、ＰＣＲ仪、可调微量移液器等。１．４病毒ＤＮＡ的提取和保存１．肺脏取适量姐织样品放在含有钢珠的离也管（２ｍＬ）中研磨２分钟。（鼻腔拭子和一步骤肛口拭子无这）２．加入适量的纯水，放置离也机（８０００ｒ／ｍｉｎ）２分钟，取上清液３００ＵＬ°上清液中加入？３，１．５２ｈ．在２５０山裂解液加入１０ｕｌ蛋白酶Ｋ。％Ｃ水浴，加入等量的Ｔｒｉｓ平衡酪充分混匀。４（２００ｒ／ｍｎ）５分钟，．在离也机中１ｉ取上清液３００Ｐ１加入等量的氯仿充分混匀，离也（１２００ｒ／ｍｍ）５分钟，取上清２００Ｕ１入５００ｉＵ，２０Ｗ醋酸钢混匀。，加无水石醇再加入离也（１２００ｒ／ｍｉｎ）５分钟，将溶液倒掉。１３ 湖南农业大学硕±（全口制专业硕＋）学位论文５甚离也管中加入７５％的酒精ＩｍＬ，离也（８０００ｒ／ｍｉｎ）１分钟，倒掉溶液，再次离也－（８０００ｒ／ｍｉｎ）１分钟，将离也管置于烘干化烘干，加入５０ｕｌ纯水混匀放量在８ＣＴＣ保存。１．５．引物的设计ｅｎＢａｎｋ２－在ＮＣＢＩ上Ｇ数据库中找到四个血清型的序列（表１），再用Ｂｌａｓｔ同源性分析对每个基因序列进行保守性分析，找出各自的保守序列。其中ＰＡＤＶ３和ＰＡＤＶ５在保守的六邻体部位设计引物ＰＡＤＶ１ＲＦ１－５区域设计，ＰＡＤＶ４在Ｅ１Ｂ区域，在基因０设计。用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件根据保守序列对四个血清型进行引物设计。设计的引物应符合一一Ｗ下要求：四对引物与各自的血清型之间对应，并且不交叉扩增，扩增产物的长°度能够清晰的区分。引物的湿度在５５Ｃ左右，引物中的ＧＣ含量在５０％之间，引物内１？部和引物之间不会出现连续互补结构，引物大小在８２２ｂｐ之间，按照Ｗ上要求设计８８２－２出对引物，对引物（表。）２－表１猪腺病毒各血清型基因序列Ｔａｂ－ｌｅ．２１Ｅａｃｈｓｅｒｏｔｙｐｅｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒａｌｅｎｅｓｅｕｅｎｃｅｓｐｇｑ猪腺病毒毒血清型登陆号大小ＰＡＤＶ１Ｌ４３：３６４．１１９９３ｂｐＰＡＤＶ３ＡＦ０８３１３２．Ｉ３４０９４ｂｐＰＡＤＶ３ＡＢ０２６Ｉ１７．１３４０９４ｂｐＰＡＤＶ３ＡＣ０００１８乂Ｉ３４０９４ｂ＿ｐＰＡＤＶ３ＡＪ２３７８Ｉ５．１３４０９４ｂｐＰＡＤＶ３ＢＤ２３５９２６３４０９４ｂｐＰＡＤＶ４Ｕ１２８９３．１ＳＯＯＯｂｐＰＡＤＶ５ＡＣ０００００９．１３２６２１ｂ＿＿ｐＰＡＤＶ５ＮＣ００２７０２．１３２６２１ｂｐ＿ＰＡＤＶ５ＡＦ２８２．犯６１３２６２化ｐ表２－２猪腺病毒引物－２ＴｈｅｒＴａｂｌｅ２ｉｍｅｒｏｆｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｐｉｓｋ引物序列产物长度１４ 第二帝猪腺病多重ＰＣＲ方法建立：ＰＡＤＶ１ＰＡＤ１Ｆ６下ＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＡＧ２３化ｐＰＡＤ１民６ＣＧＣＧＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＧＣＧＴＰＡＤ１Ｆ１ＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＴＣＴ５９２ｂｐＰＡＤＩＲＩＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＣＣＡＣＴＡＴＣＰＡＤＶ３ＰＡＤ３Ｆ２ＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡ２７８ｂｐＰＡＤ３Ｒ２ＣＣＧＴＴＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＧＣＧＰＡＤ３Ｆ３ＧＡＣＡＣＫＣＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＡ１０７刪ＰＡＤ３民３ＧＡＣＣＧＣＴＣＣＧＴＴＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＰＡＤＶ４ＰＡＤ４Ｆ１ＧＧＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴ７１６ｂｐＰＡＤ４民１ＣＴＣＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＰＡＤ４Ｆ２ＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＴＣＴ３０８ｂｐＰＡＤ４Ｒ２ＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＣＰＡＤＶ５ＰＡＤ５Ｆ２ＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡ４８４ｂｐＰＡＤ５Ｒ２ＣＣＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＴＣＰＡＤ５Ｆ１ＣＴＴＹＣＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＡＡ１４５５ｂｐＰＡＤ５民１ＣＡＣＧＴＴＧＣＧＧＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＣ１．６ＰＣＲ方法的建立１．６．１单重ＰＣ艮方法的建立和优化１、ＰＡＤ３、ＰＡＤ４和ＰＡＤ５的ＤＮＡ后在获得ＰＡＤ，按照下反应体系进行反应单重ＰＣ民体系（１５．６Ｕ１）如下：１５ 湖南衣业大学硕±（全日制专业硕古）学位论文１Ｍｉｘ７ｕｌ（）２ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ０．３Ｐ１（）３民ｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ０．３ｕ１（）（４）模板１ｕ１５ｄｄＨ〇７１（）２１１ＰＣ民循环参数：体系配制完成，经过离也，将其放在ＰＣ艮仪上进行扩增反应，优°。°一４Ｃ５ｍ二４Ｃ３化０７２：化后的程序为：：９ｉｎ。：９巧Ｃ３ｓ，Ｃ３０ｓ（２。兰，个循环）°°°’’°°°９４Ｃ３０ｓ，５７Ｃ３０ｓ，７２Ｃ３０ｓ（２个循环）。四：９４Ｃ３０ｓ，（５４Ｃ、５５Ｃ、％Ｃ、５７Ｃ°°’‘和５８Ｃ退火温度梯度）３化，７２Ｃ３０ｓＧ５个循环）。六：７２Ｃ７ｍｍｌ５Ｃ保存。反应结束后，取ＰＣ民产物各５ｕｌ，ＤＮＡｍａｒｋｅｒ５Ｕ１点样到含有ＥＢ的１％的琼脂糖凝臉在１３０Ｖ、１３０ｍＡ条件下２０ｍｉｎ。取出ＰＣＲ产物各５ｕｌ凝胶放入凝胶成像仪，打开紫外线，，确定最优的退火温度观察产物的扩增大小和扩增效果。对退火温度进行摸索。将每个反应体系进行优化，选出最合适的单个反应体系。１．６．２单重ＰＣ民产物的回收与测序ＰＣ民产物纯化具体步骤：（１）取５ＵＩＰＣ民产物在琼脂糖凝胶进行电泳。（２）在紫外灯下切下含有目的片段的凝胶，用滤纸洗净表面的液体。０）用电子天平测量凝胶质量，加入３．５倍凝胶体积的缓冲液。（４）加热至完全融化后将琼脂糖溶液加入回收柱内，加入缓冲液洗淺柱子，再（８０００ｒ／ｍｉｎ）５分钟．（５）倒掉过滤液，重复步骤（４）（６）将回收柱放置于灭菌的离必管上，加入ＤＮＡ洗脱液，静置２分钟，离也（１２０００ｒ／ｍｉｎ）２分钟脱出ＤＮＡ。（７）艮将回收后的ＰＣ产物，送往深切伴大基因公司进行测序。１．６．３多重ＰＣ民方法的建立和优化１６ 第：．＿章巧腺病多重ＰＣＲ方法建去．．３．１ＰＣ艮１６多重方法的建立初步的多重ＰＣＲ反应体系：多重ＰＣ民体系（３２．４Ｕ１）如下：ｌＭｉｘ１５ｕｌ（）ＦｏｒｗａｒｄＰｒ．Ｘ４ｕｉｍｅｒ０３ｌ每个血清型０．３Ｕ１口）（）饼民ｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍ針０．３Ｘ４ｕｌ（每个血清型０．３ｕ１）（４）模板４ｕｌ（每个血清型１ｕ１）５５ｕ加化０１１（）１．３．２．６多重ＰＣ民方法的优化一优化反应条件，在设计单重ＰＣ艮时就考虑到温度要样，为Ｗ后条件的优化提供’便利，所ＷＰＡＤ１、ＰＡＤ３、ＰＡＤ４和ＰＡＤ５的设计退火温度都是５５Ｃ。多重ＰＣ民的温°°°°°度就是在５５Ｃ上下波动，Ｗ５３Ｃ、５４Ｃ、５５Ｃ、和５７Ｃ进行优化，选出合适的温度对退火时间、变性时间、延伸时间、循环次数这四个几个条件进行优化。反应结束后，取ＰＣ民产物各５吐ＤＮＡｍａｒｋｅｒ５山点样到含有閒的１％的琼脂糖凝肢在Ｉ３０Ｖ、１３０ｍＡ条件下２０ｍｉｎ。取出凝胶放入凝胶成像仪，打开紫外线，观察产物的扩增大小和扩增效果。对退火温度进行摸索，确定最优的退火温度。将多重ＰＣ民反应体系的温度、引物浓度Ｗ及程序进行了优化，选出最合适的多重ＰＣＲ反应体系。１．７多重ＰＣＲ特异性试验在设计这些引物时，己经对各引物的特异性进行了比对，这次设计多种肠道病毒ＰＥＤＶ对这些引物的特异性用试验的方法进行验证。这些病毒如下：猪流行腹泻病毒（）、ＴＧＥＶ（ＰＲＲＳＶ）猪传染性胃肠炎病毒（）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪杯状病毒（ＰＣＶ）、猪流感病毒（ＰＩＶ）和猪星状病毒（ＰＡＳＴＶ）。１．８多重ＰＣＲ敏感性实验在相同的反应条件和不同模板浓度进行ＰＣ民反应，验证该方法的敏感性性。选取四种血清型临床检测的阳性猪腺病毒病料，选取这些保存好的经过纯化的ＤＮＡ，用分光光度计测量其浓度并将其浓度稀释到５００ｎｇ／ｕｌ，再将其浓度分别稀释到ｌＯＯｎｇ／ｐｌ、５０ｎｇ／ｙ１、２５ｎｇ／ｕ１和５ｎｇ／ｙ１。每个血清型各取Ｉｎｇ，混合之后作为模板进行ＰＣＲ反应。１７ 湖南农业大学硕±（全日制专业硕±）学位论文２．结果２．１单重ＰＣＲ的扩増结果，经过多次试验和筛选工作猪腺病毒４个血清型的８对引物，选出４对扩增效率－血清高、特异性强的引物（表２３所示），其中血清Ｉ型的目的条带２３６ｂｐ３型的，目的条带２７８ｂｐ，血清４型的目的条带７１６ｂｐ，血清５型的目的条带４８４ｂｐ。单重ＰＣＲ反应结束后，各取出ＰＣ民产物各５山凝胶放入凝胶成像仪在紫外光下进行拍摄，可观察到２３６ｂｐ（ＰＡＤＩ图Ａ）、２７８ｂｐ（ＰＡＤ３图Ｂ）、７１６ｂｐ（ＰＡＤ４图Ｃ和４８４ｂＰＡＤ５图Ｄ。）ｐ（）民‘’°对于单重ＰＣ的温度梯度是５４Ｃ、５５Ｃ、和５７Ｃ。从结果来看，温度的影响不’°是很大，设计的温度是５５Ｃ，将５５Ｃ确定为各项单重ＰＣ民的退火温度。表２－３猪腺病毒四个血清塑的引物Ｔａｂ－ｌｅ２３Ｔｈｅｒｉｍｅｒｓｏｆｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｆｏｕｒｓｅｒｏｔｅｓｐｐｙｐ￣‘毒引物序列产物长度ＰＡＤＶＰＡＤ１Ｆ６ＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣ２３６ｂｐ＾１ＰＡＤｉ民ＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＧＣＧＴ６ＧＣＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＣＰＡＤＶＰＡＤ３Ｆ２ＣＧＴ２７８ｂｐ＾３ＰＡＤ３Ｒ２ＴＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＧＣＧＰＡＤＶＰＡＤ４Ｆ１ＧＧＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＴ７１６ｂｐ尸４ＰＡＤ４民１ＣＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＣＰＡＤＶＰＡＤ５Ｆ２ＣＧＴ４８４ｂｐ＾５ＰＡＤ５Ｒ２ＧＣＧＧＣＴＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＴＣ１２３４Ｍ１２３４Ｍ．．Ｉ巧化ｐ．辛．－離．．織ＳＯＯｂｐ．懸嗜５．碟当２７８ｂＰ？‘巧鄉２５０ｂ＂ｐ；＾瞭＂透－１０化ＰＸＯＯｂｐ既１８ 第二章猪腺病多重ＰＣＲ方法建立１２３４Ｍ１２３４ＭＷ诵Ｋ巧化Ｐ谨．某两貧’．＂＇；Ｓ阳ｂｐ４８４ｂＳＯＯｂｐ＿若：ｐ．｜｜’２Ｓ〇ｂＰ＾５駭繁祭驚薦邮ｌＯＯｂｐＩＭｂＨＰ２－２ＡＣＲ图．Ｂ．Ｃ．Ｄ为猪腺病毒四个血清型单项Ｐ在不同温度下扩増的结果Ｍ‘’‘‘：ＤＮＡ标准尺度１：５４Ｃ２：５５Ｃ３：５６Ｃ４：５７Ｃ分子；；；Ｆｉ．Ａ．Ｂ．Ｃ．ＤＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｓｅｒｏｔｅｓｆｏｕｒｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｄｉｖｉｄｕａｌＰＣＲａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｔｇｙｐｐｐｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｓｐＭＮＡ＂＂＂＂ｎｄａ２：５５３：５６：ＤＳｔａｒｄｓｃａｌｅ１：５４ＣＣＣ；４；５７Ｃ；；２．２单重ＰＣＲ产物的鉴定结果＿将单重ＰＣＲ的电泳产物回收后送到华大基因测序后显示如下：血清〇Ｉ型与ＮＣＢＩ公布的序列同源性９１％，血清３型和ＮＣＢＩ公布的序列同源性８９／〇，血清４型和ＮＣＢＩ公布的序列同源性９６％，血清５型和ＮＣＢＩ公布的序列同源性９４％，确定检测到的病毒为猪腺病毒。２．３多重ＰＣＲ方法的建立和优化结果２．３．１多重ＰＣＲ的引物浓度的优化结果－，分别进行ＰＣ民反应３取不同引物的浓度，摸索出最好的引物浓度。结果如图２所示。引物在０．６ｕｍｏｌ／Ｌ条带较清晰。１２３４５６７Ｍ７１６ｂＰ２ｓ化２巧ｂｐ？ｐｈｉ可ｌＯＯｂｐ巧 湖南农业大学硕±（全日制专业硕±）学位论文图２－３多重ＰＣＲ在不同弓Ｉ物浓度ＰＣＲ扩増结果Ｍ：ＤＮＡ分子标准ｕｍｏｌ／Ｌ）分别为１：０．６２：：０５４：０．４５：５：．１尺度引物浓度（；０．巧；３．；０；６：０．０５７：纯水；—ｒｅｓｅｒｅｎｃｏｎｃｅｎｒａＦｉｍｅｉｅｘｉｇ．２３ＴｈｅｕｌｔｏｆｄｉｆｆｔｔｔｉｏｎｒｒｓＭｕｌｔｐｌＰＣＲｐＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｒｉｔｅｒｉａｆｒｏｍｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（口ｍｏｌ／Ｌ）ｗｅｒｅ１：０．６；２：０．５５；３：０．５；４：０４５．：５：０．１６：０．０５７：ｕｒｅｗａｔｅｒ；；ｐ２．２．３多重ＰＣ民的退火温度的优化结果一台ＰＣ民仪用同，分别用不同的退火温度进行反应，最后摸索出最适合的ＰＣ民２－４所示多重ＰＣＲ体系退火温度在５５Ｃ时综合效果最好退火温度。如图。王２３４Ｍ国国７ＳＯｂｐＳＯＯｂｐ＇ｊＣｍＩ２５０ｂｐ．．ｆａｍｌｏｏｂｐ图２－４多重ＰＣＲ在不同退火温度下的ＰＣＲ扩増结果Ｍ°’’：ＤＮＡ分子标准尺度１：５４。２：巧Ｃ；３：％Ｃ；４：巧Ｃ＊－ＭｕＦｉ２４ｌｔｉｌｅｘＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓａｄｉｒｅｎｔａｎｎｅａｌｉｎｅｅｒａＵｉｒｅｓｇ．ｐｔｆｆｅｇｔｍｐＭ＊＊＊＾；ＤＮＡＳｔａｎｄａｒｄｓｃａｌｅ１：５４Ｃ；２：５７Ｃ；３：５６Ｃ；４：５５０２．３．３多重ＰＣ民特异性试验－ＡＤＫＰＡＤ首先是对多重ＰＣＲ的四个引物进行特异性试验，１６泳道模板分别为Ｐ３、ＰＡＤ４５ＰＡＤＰＡＤ３ＡＤ４ＰＡＤ５－５）二、ＰＡＤ、１Ｐ和水（如图２所示。是用多重ＰＣＲ的ＰＣＲ检测ＰＣ民引－，１四个引物对其他肠道进行，来检测此多重物的特异性６泳道分别为猪腺病毒（ＰＡＤＶ）阳性对照、纯水、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）、猪杯Ｖ）ＡＳＴＶ－状病毒（ＰＣＶ）、猪流行腹泻病毒（ＰＥＤ、猪星状病毒（Ｐ）如图２６所示，该方法特异性良好，１。，在猪腺病毒各血清型有很好的区分度在其他肠道病毒的特异性２０ 第二青猪腺病多重ＰＣ民方法建立１２３４５６Ｍ瑪ＢＷ７ｂ５ｏｐ＊＊＊＊ＳＯＯｂｐ＂化ｎ：三ｐＩＤＯｂｐ图ｔ５猪腺病毒四个血清型的特异性试验ＤＮＡ：血清１型ＤＮＡ模板２：３型ＤＮＡ模板３：血４型ＤＮＡ模扳４Ｍ血清：：；分子标准尺度１清パ型ＤＮＡ模板５：血清１、３、４、５血清型ＤＮＡ模板；６：纯水２－ＴｈｆｉｌｌｆＦｈｅｆｏｕｅｓｏｆｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｉｇ．５ｅｓｐｅｃｉｃａｙｏｔｒｓｅｒｏｔｙｐｐｓｌｅ３ＤＮｌ３：Ｍ：ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓｔａｎｄａｒｄｓｃａｌｅ１ｅｒｏｔ１Ｄｔｅｍａｔｅ２ｅｒｏｌＡｔｅｍａｔｅ：ｓｙｐｅＮＡ：ｓｐ；ｙｐｐ；Ｓｅｒｏｔｙｐｅ４ＤＮＡ化ｍｐｌａｔｅ；４；ｖ５ｔｙｐｅＤＮＡｔｅｍｐｌａ化５：ｌｖ５，４，５ｓｅｒｏｔｙｐｅｓｅｒｕｍＤＮ乂ｋｍｐｌａｔｅ；６：１２Ｍ３４５６１７１６ｂｐｆ＼ＷＭ７Ｓ０ｂｐ４Ｓ４ｂＳＯＯｂｐｐ２７８ｂｐ。化ｐ巧化ｐｌｏｏｂｐ图２－６其他肠道常规病毒的特异性试验Ｍ：ＤＮＡ分子标准尺度：１：猪腺病毒（ＰＡＤＶ）：２：纯水；３：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）：４：猪杯状病毒（ＰＣＶ）：５：猪流行腹泻病毒（ＰＥＤＶ）！６：猪星状病毒（ＰＡＳＴＶ）；－化ｅＦｉ２ＴｈｅＳｅｃｉｆｉｃｉ化ＳｏｃｏｎｖｅｎｔｉＮｎｔｔｉｎａｌｖｉｒｕｓｇ．６ｐｔｙｔｆｏｎａｅｓＭ：ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓ化ｎｄａｒｄｓｃａｌｅ；１：Ｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（ＰＡＤＶ）；２：ｗａ化ｒ；３：ｐｏｒｃｉｎｅ＾ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａ化ｒｙｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳＶ）巧ｎｄｒｏｍｅ；４：ｐｉｇｃａｌｉｃｍｒｕｓ（ＰＣＶ）；５：ＰｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｉｒｕｓＰＥＤＶ６：ｏｒｃｉｎｅａｓｔｒｏｖｓＰＡＳＴＶ（）；ｐ（）；２．３．４多重ＰＣＲ敏感性试验在相同的反应条件和不同的模板在同一台ＰＣＲ仪上进行５次ＰＣＲ扩増，验证反应－－４００ｎ／口体系的敏感性。图２７中１５泳道的模板浓度分别为１、ｌＯＯｎ／ｐｌ、５０ｎｇ／ｕｌ、ｇｇＵ和／－２５ｎｇ／ｉ５ｎｇ１ｘ１。根据检测结果如图２９所示，在送５个批次的浓度下扩增效果良２１ 湖南农业大学硕±（全日制专业硕±）学位论文４００ｎＯＯｎ５０ｎｉ２５ｎ好，／ｕＫｌ／Ｍ／ｔｌ，没有明显的差别／ｕｌ在ｇｇ和ｇ时条带清晰，在ｇ１ｘ和５１１８／１１肘亮度稍暗，在５ｎｇ／＾ｌ条带最淡，不过也可臥观察到。１２３４５ＭＭＭｒｓ－ｂｐ：隊＂ｓｂｐ２ｓ化ｐ曲基玉ＤＯｂｐ图猪腺病毒多重ＰＣ民敏感性试验检测结果Ｍ：ＤＮＡ分子标准尺度１：４００ｎ／ＵＩ２：ｌＯＯｎ／Ｕ１３：５０ｎ／Ｕ１４：２５ｎ／Ｕ１５：５ｎ／Ｕ１ｇ；ｇ；ｇ；ｇ；ｇ；Ｆ－ｉ２７ＴｈｅｅｓｕｌｓｏｆｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓｍｕｌｉｌｅｘＰｄｅｅｃｉｏｎｓｅｎｓｉｉｖｉ．ｔｓｔｒｅｔｔＣＲｔｔｔｔｇｐｐｙＭ：ＤＮＡｓｔａｎｄａｒｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｃａｌｅ１：４００ｎｇ／口Ｉ；２；ｌＯＯｎｇ／ｆｉｌ；３：５０ｎｇ／口Ｉ；４：２５ｎｇ／ｆｉｌ；５：５ｎｇ／ｆｉｌ；２．３．５多重ＰＣＲ临床试验一一些临床上检测到的阳性病料，选取，单的或者泡合的阳性病料进行检测检测其－在临床的应用的效果，检测结果如下图２８．１２３４５６７８￥Ｍ—Ｉ—图２－８猪腺病毒临床试验检测结果１２３３４４５３Ｍ；ＤＮＡ分子标准尺度１：血清型；：血清郵：血清型；：血清５型；：血清、４、５型；０＆Ｌ清１、５型；７．血清１、４、５型；义血清３、４、５型；９．血清１、４型；Ｆ－ｉｇ．２８ＰｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｃｌｉｎｉｃａｌｔｅｓｔｉｎｒｅｓｕｌｔｇＭ：ＤＮＡｓｔａｎｄａｒｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｃａｌｅ１：ｓｅｒｏｔｙｐｅ１ＤＮＡｔｏｎｐｌａｔｅ；２：ｓｅｒｏｔｙｐｅ３ＤＮＡｔ：ｅｍｐｌａｔｅ；；３；ｏｔｅ４ＤＮＡｅｍｌａ化４：ｓｅｒｏｅ５ＤＮＡｅｍｌａｅ５：ｓｅｒｏｅ３４５ＤＮＡｔｅｍｌａｔｅ６；ｔｓｅｒｙｐｔｐ；；ｔｙｐｔｐｔ；巧ｐ、、ｐ；ｓｅｒｏｙｐｅ１、５ＤＮＡ化ｍｐｌａｔｅ；７：ｓｅｒｏｔｙｐｅ１、４、５ＤＮＡ化ｍｐｉａｔｅ；８：ｓｅｒｏ１：ｙｐｅ３、４、５ＤＮＡ化ｍｐｌａｔｅ；９；ｓｅｒｏｔｙｐｅ１、４ＤＮＡ化ｍｌａ化ｐ；２２ 巧二靑蹤腺病《重ＰＣＲ方法建立２．４．讨论目前对猪腺病毒的研究相对较少，猪腺病在猪群中的感染率相对较高，英国某些地区高达５３％。我们目前对猪腺病毒的诊断手段主要为电子显微镜观察、感染细胞的免疫巧光、免疫组织化学染色检测病毒抗原检测、血凝中和实验、琼脂免疫扩散实验。一ＰＣ民这些手段价格昂贵，步骤相对繁琐些人用，国内外有方法对猪腺病毒进行检测，不过迄今为止，ＰＣ艮还未作为临床样品检测的常规诊断方法，最主的原因是目前只用ＰＣ民方法检测出血清３型和５型。本文建立血清１，３，４，５型的多重ＰＣ艮方法，用快速便捷的方法迅速检测出临床样品中猪腺病毒的血清型，为猪腺病毒的临床研究提供便捷经济的手段，为大量检测猪场病料成为可能，可Ｗ做相关地区的流行病学调查，为进…步研究腺病毒流行情况作技术上的有为支撑。民一Ｐ多重ＰＣ民是在单重ＰＣ基础上进行的，但并不是单Ｃ民简单的混合。常常需要考虑反应条件和反应体系的调整。要确保所有的靴位点可［＾用相同的反应程序都得，打到最大扩増效率到有效的扩增要将每个单重ＰＣＲ的程序和反应条件进行优化；；一ＰＣＲ平衡每个引物的量，使每个靴位点都能够得到足够的扩增量。相比单普通，多民重ＰＣ对检测样本要求高，需要污染少，病毒含量高新鲜的病料。对操作实验的人员素质有很高的要求，在实验过程中样品处理不及时，ＤＮＡ提取过程中污染，Ｗ及试剂仪器在操作过程中不规范不可Ｗ，都会引起检测结果的假阳性和假阴性结果。要求实验人员熟知操作原理的前提下，严格按照操作流程，反复多次练习和学习，注意实验室环境，避免污染，避免人为因素导致的错误。引物的设计在多重ＰＣＲ方法建立中尤为重要，特异性好、扩增效率高的引物为多一…一些规律步些规则和，但是这些规则重ＰＣ民方法建立成功的第。设计引物虽然有一一一设计的方面比较多，无法满足，设计者需要多次练习，积累些实践经验，查阅大量文献，为引物的设计做出充足的准备。多次ＰＣＲ由于有几对引物，多重ＰＣ民引物之间会有非特异性条带，引物之间也会出现互相结合，需要大量多次的实验选出合适的引物对，，这花费了设计人员大量的时间和精力对研究进度造成很大的影响。我们可用ＮＣＢＩ的引物特异性评估系统（ＰＳＣ），这个系统明显减少引物不合理情况的出，快速、有效地选出最佳的引物现，提高引物的扩增效率和稳定性，减少科研经费的浪费，节省试剂，节约时间，节省人力，加快相关研究的进程，合理统筹，在很多重大疾病的排查和筛选Ｗ及疾病流行病学调查发挥重要的作用。２３ 湖南农业大学硕±（全ｕ制专业硕止）学位讫文ＰＣ民扩增条件也是关键因素之一。退火温度的优化，由于多重ＰＣ民有多对引物，设计时引物的温度的预期退火温度和实际温度是有差别的，所设计预期退火温度时一样或者相近将每个引物的温度设置成，这样就不至于各引物退火温度之间相差不是太大，找到最佳的退火溫度。在这个基础上设置试验退火温度在预期温度上下波动；延伸时间的优化，普通单重ＰＣ民延伸时间只要根据目的条带长度经过计算就行，多重ＰＣ民要根据各自的目的条带选出最大的目的条带进行计算１－２５经过多，并适当增加０Ｓ，次调整，找到最佳的延伸时间；循环圈数的优化，对于多重ＰＣ民来说，不需要多增加ＰＣ民循ＰＣ民－２ＰＣ民，当条带较暗，可Ｗ增加１，环圈数个循环圈数；反应程序的优化一多重ＰＣ民引物较多，模板比较复杂，反应时不可Ｗ避免的会有些非特异性扩增，反°’４－应程序的设计可Ｗ在ＤＮＡ变性后，设定退火温度提高Ｃ８Ｃ，每次递减ｒＣ，当降一到原退火温度后直反应下去，这样可Ｗ大大减少非特异性扩增，减少杂带的产生，使多重ＰＣＲ扩增效率提高，。多重ＰＣ民经过这么多年的发展在很多行业如食品、环境、检疫、生物、刑侦、医学等很多领域发挥着越来越重要的作用。２４ 第Ｈ章．猪腺病毒多重ＰＣＲ方法的应用第Ｈ章．猪腺病毒多重ＰＣＲ方法的应用１．材料和方法１．１样品的采集和处理２０１３１２－２０１５２７５１２９３年月年月采集了份样品，份来自湖南、江西、江苏的部１７３分地区各年龄层猪肛口拭子，６０份来自湖南某屠宰场的肺，份来自湖南、江西、江苏的各年齡层猪鼻腔拭子，２５份来自本实验室的肠道送检病料和２０份肺部送检病料，１８０份来自湖南某养殖企业５个养殖场的血清。其中鼻腔拭子和肛口拭子来自断奶２５－３５－４５日龄４５－Ｈ个阶段。肛口拭子分后的仔猪，年龄层分别为３５日龄，，６０日龄腹泻仔猪和正常的健康仔猪。鼻腔拭子分为呼吸急促病猪和正常的健康仔猪。其中猪２５－３５３５－４５日４５－场血清的年龄层为日龄，，６０日龄Ｈ个阶段：龄。肛口拭子采集用２－３ｃｍ棉花拭子在生理盐水中浸湿，插入肛口处，自肛口周围皱髮处拭取，或在肛口曰内轻径旋转涂擦，然后插入盛有生理盐水的试管内。做粪便拭子培养，Ｗ上操作均°需使用无菌器材，并将拭子放入灭菌试管应将粪便标本放入４ＣＷ下保存和带冰运送。－８（：如果需要长期保存的标本，ＴＣ保存鼻腔拭子采集应加入少量防腐剂；用棉花拭子２－在生理盐水中浸湿，插入猪鼻孔４ｃｍ处旋转几周，保存Ｗ及材料同肛口拭子；血清采集：用常规真空管采集：：肺的采集采集过程中观察是否肺部病变并作记录。１．２．相关试剂试剂：裂解液、醋酸钢、琼脂糖、无水乙醇、Ｔｒｉｓ饱和酪、蛋白酶Ｋ和无水醇为３ＤＬ２ＤＮＡＭＴＲＰＣ民国产分析纯．０、０００ａｒｋｅｒａＫａａ；即用型ＰＣ民试剂盒购自公司；引物由华大基因公司合成。溶剂：电泳缓冲液：５０ＸＴＡＥＢｕｆｆｅｒ配制方法：１．用天平称氨基下王醇２４２ｇ，ＮＡ２ＥＤＴＡ２Ｈ２０３７．２ｇ放入１Ｌ烧杯中；２．往烧杯中加入８００ｍｌ纯水，揽拌并混匀，加入５７ｍｌ的冰乙酸；３加入纯水定容到１Ｌ，室温保存。使用时需要稀释５０使用。１Ｉ漠化乙锭：在００ｍｌ水中加入ｇ漠化乙锭，磁为揽拌数小时Ｗ确保其完全溶解，然后用铅箱包裹容器或转移至踪色瓶中，保存于室温。注意：漠化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，有致癌的可能，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴防毒面罩。醋酸钢：配１升的溶液，可在６００ｍＬ去离子水中加４０８．２４ｇ水ＮａＡｃ，配成３ｍｏｌ／Ｌ。２５ 湖南农业大学硕±－（全円制专业硕上）学位论文－Ｎ裂解液：裂解液配方为１００ｍｍｏＨ２５ｍｍｏＥＤＴＡ５００ｏｌ１％ｌＴｒｉｓｃｌｌｍｍａｃｌ，ＳＤＳ。，，ｌ－．ｌＯＯｍｍｏＩＴｒｉｓＨｃｌＴｒｉｓ３０２８５５０ｍＬ２．２５ｍｍｏ旧ＤＴＡ１．拉６５称取．ｇ纯，加入水；称取ＥＤＴＡ，力口入５０ｍＬ纯水ＳｍｏｌＮａｃｌ称２９．２２Ｎａｃ１Ｉ力入９０ｍＬ纯水％ＳＤＳ称取；取ｇ，口；ＩｇＳＤＳ，力ｎ入ｌＯＯｍＬ纯水。琼脂糖．２００ｍ：在电子天平上称取１６琼脂糖，放入烧杯中，加入稀释好的ＴＡＥｌｇ，将烧杯置于微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，稍微冷却片刻，加入漠化乙锭，充分混匀。１．３．主要设备仪器‘’－２０Ｃ冰箱－Ｃ冰箱、超净工作台、高、８０速冷冻离也机、精密电子天平、凝胶成像系统、琼脂糖电泳槽、ＰＣ民仪、可调微量移液器等。１．４．病毒ＤＮＡ的提取和保存１．取适量肺脏样品放在含有钢珠的离也管（２ｍＬ）中研磨２分钟。（鼻腔拭子和肛口拭子无这一步骤）２．加入适量的纯水，放置离也机（８０００ｒ／ｍｉｎ）２分钟，化上清液３００山。°上清液中加入２－３ｌ，５６Ｃ水浴１，．在５０ｕ裂解液加入ｌＯｕｌ蛋白酶１Ｃ。．５２小时加入等量的Ｔｒｉｓ平衡酪充分混匀。４．在离屯机中（１２００ｒ／ｍｉｎ）５分钟，取上清液３００山加入等量的氯仿充分混匀，离必（１２００ｒ／ｍｉｎ）５分钟，取上清２００ｕｌ加入５００山无水乙醇，再加入２０ｕｌ醋酸钢混匀。离必（１２００ｒ／ｍｍ）５分钟，将溶液倒掉。５．在离也管中加入乃％的酒精１ｍｌ，离必（８０００ｒ／ｍｉｎ）１分钟，倒掉溶液，再次离必（ｒ／ｍ－８０００ｉｎ）１分钟，将离也管置于烘干机烘干５０ｕ（Ｔ，加入ｌ纯水混匀放置在８Ｃ保存。２．结果２．１．对样品的检测结果分析用建立的猪腺病毒多重ＰＣＲ方法对所有样品进行检测，ＰＣＲ反应完成后，各取出ＰＣ民产物各５山凝胶放入凝胶成像仪在紫外光下进行拍摄，详细记录结果并分析。２６ 第吉章巧腺病多重ＰＣＲ方法的惦用２．２猪腺病毒在各地检测猪场的感染分布情况这次检测的样品来自湖南浏阳的２个猪场，湖南巧罗的２个猪场，湖南长沙的１一一个猪场，２，个猪场，个猪场湖南长沙的某家屠宰场江西的个猪场江苏的长沙的，，一３－１。和实验室的送检样品。猪场感染情况如表共８个猪场，７个猪场检测到猪腺病，８６家猪场规模较（繁殖母猪，２毒家养殖场大１０００头Ｗ上）家是家庭作坊式猪场（５００头繁殖母猪Ｗ下），１家未检测到猪腺病毒的猪场管理规范，养殖效益巧好，在去年行情较差的情况下依然盈利，未检测到猪腺病毒可能跟其严格科学的饲养管理有关，猪群抵抗力较强，猪腺病毒在抗体效价较高时可Ｗ阻止和预防病毒的主动复制，目前猪腺病毒表现得是离感染性和低致病性，没有专口的疫苗进行防治，加强饲养管理、减少猪群应激、増强猪群抵抗力是目前可行的减少猪腺病的发病几率。江苏盐城的猪场养殖的是藏香猪，猪腺病毒感染率最低，二元猪感染率适中，±杂猪感染率最高，感染率较低的猪场管理相对严格。实验室送检病料和屠宰场均检测到猪腺病毒。根据所检测地区猪腺病毒分布较广，虽然目前的研究来看，猪腺病毒在猪群中的致病性不高，但猪腺病毒的高感染率势必影响饲料的料肉比，猪腺病毒参与混合感染，当猪腺病毒血清４型与猪肺炎支原体结合会导致更加严重的肺炎猪腺病毒的其他进一步危害尚在研究之中一，需要进步深入研究。表３－１猪腺病毒在各地的感染情况Ｔａｂ－ｌｅ３１Ｔｈｅｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌａｃｅｓｐｐ猪场地址盐城宜春宜春长沙泪罗巧罗浏阳浏阳母猪规模５０头１０００头８００头８００头２０００头１０００头１０００头４００头．％７感染率６％１３．３％１．５％６％．５１２．５１６％０７％％品种藏香猪±杂±杂二元二元二元化长大王杂饲养管理一般恶劣恶劣良好良好良好一般一般２７ 湖南农业火学硕卡（全Ｍ制专业硕＋）学位论文２．３猪腺病毒在所检测器官中的感染情况检测的样品有共有八，３１８份猪肛口拭子，８０，１７３１份样品份猪肺脏份猪鼻腔拭子，１８０份猪血清。其中肛口拭子检出６６份阳性，其中血清１型２份，血清３型４４，，血５２，其中血清０，血份血清４型１０份清型份；猪肺脏的检出６份１型份清３型０份，血清４型３份，５型３份鼻腔拭子，２，血清３血清１８份其中血清１型份；型６份，血清４型１０悅，血清５型０份血清的检出为３份，其中血清４型３份，；猪０。样品的检出感染率如下表所示３－２其余血清型均为。根据数据统计结果可见在肛口拭子中检出率最高，血清中检出率最低，鼻腔拭子和肺脏的检测率略低于肛口拭子。在猪血清中检出猪腺病毒在中国是首次报道，表明猪腺病毒有导致猪病毒血症的可能，１同样的哺乳动物腺病毒属的人腺病毒研究比较深入，９８０年北京赵锦铭氏等报道腺病口Ｗ毒存在病毒血症。国外通过血清学额研究腺病毒的数据表明，大多数成年动物具有腺病毒抗体，，感染通常是亚临床的但其临床发病率较低。通过病毒中和免疫扩散测＂－［１４验，英国某地区５０％６０％的成年猪具有猪腺病毒抗体。魅北克市猪腺病毒型的患口－病率为１５．２％气本次检测猪腺病毒血清４型感染率为１．６６５．７８％，血清３型－－－．％．１．６６％２０７８，血清１型０％０６２％，血清５型０％３Ｊ５％。血清３型的检出率最高，在各种样品均检测到，血清３型在肛口拭子的检出率島达２０．７５％；血清４型在鼻腔拭４［Ｗ子和肺脏中检出率较高，仔猪在人工接种猪腺病毒血清型时会引发肺炎血清４型，Ｐ和猪肺炎支原体结合可Ｗ引发更加严重的肺炎气４型在肺脏和肺部连接器官中检出了较高的检出率，从临床上说明了猪腺病毒对猪群的影响５。在血清型和血清１型检出率较低。表３－２猪腺病毒在各个样品中的感染情况Ｔａｂ－ｌｅ３２Ｔｈｅｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｅａｃｈｓａｍｌｅｐｐ样品名称肛口拭子鼻腔拭子Ｍ肺脏３样品数量１８１７３１８０８０阳性数量６６１８３６总阳性率２０．７５％１０．４％１．６６％７．５％血清１型阳性率０．６２％１．１５％０％０％血清３型阳性率１３．８３％３．４６％０％０％〇％％血清４型阳性率３．１４／〇５．７８％１．６６３．７５血清５型阳性率０．６２％ｍ３．７５％＾２８ 第兰章猪腺病多重ＰＣＲ方法的应用２．４猪腺病毒感染与季节的关系３－这些样品大部分采集都是从２０１．１２２０１５．２采集自各个猪场。肛口拭子阳性病料－共６６份，其中春季２３份、夏季１６份、秋季１７份、冬季２０份；鼻腔拭子阳性病料１８份，其中春季５份、夏季６份、秋季２份、冬季５份；血清由于都采集于夏季，有３份阳性病料６份，其中秋季４、冬季２份。从上；猪肺脏采集自秋冬两季阳性病料份述数据可见，猪腺病毒在各个季节感染率变化不是很大，猪腺病毒的发病并无明显的３－季节性，见图１。：广２０广］ｒ—ｎ——口帆巧５１ｊＩ■鼻腔拭子广１〇□赚．’潘—＾—ＭｉＪｉ５■Ｉ＾ＪｊＬ．Ｊｌｉ１ｉ．ｌｉ１Ｊｒ．．春季ＩＩ鮮《季图３－１猪腺病毒在四个季节的感染情况？也Ｆ－ｎｓｉｇ．３１Ｔｈｅｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｆｏｕｒｓｅａｓｏｐ＂２．５猪腺病毒感染与仔猪年龄的关系采集的样品猪鼻腔拭子和肛口拭子是按照Ｈ个年龄层来采集的，年龄层分别为－２５３５日龄３５－４５日龄４５－６０８０，，日龄Ｈ个阶段。６０份屠宰场的猪肺脏都是成年猪，１－９０６２５－３５份血清采集自７０日龄的育肥猪。其中肛口拭子阳性病料６份，日龄１７份，－－３５－４５５－６０日龄１日龄巧份，４１０化鼻腔拭子阳性病料８份，２５３５日龄２份，３５４５－－日龄１３份，４５６０日龄３份；肺脏是成年猪，阳性病稱６化血清是７０９０日龄仔猪，－３－阳性病料份。检测结果如下图所示：３２从下面的图表可Ｗ看出在２５３５日龄逐渐增－－加，在３５４５日龄时感染数量达到最高峰，４５６０日龄逐渐降低，之后感染率越来越低。多数的成年猪对腺病毒的免疫反应显示阳性结果，仔猪在哺乳后，抗体低度在短时间，５内达到最高值并持续断奶后的几周按照目前的感染情况来看，仔猪在４日龄时巧乳一时间猪腺病毒的感染率达到最高峰抗体滴度大大减少，所Ｗ在这，在６０日龄母源抗２９ 湖南农业大学硕＋（全日制专业硕＋）学位论文体减少，不过由于自身免疫抗体的产生，在此阶段后，感染又逐渐降低到比较低的水Ｓ１［］平，母源抗体对猪腺病毒是具有保护作用的。＇－４Ｍ；有：巧〇｜—巧！＇３０—巧□时诚子三ＩＩ■顯子；—Ｉ□脯：Ｉ－－：＾１５｜１｛。－－－－２５％３５４５４５６０７０９０成年猪日脖日龄日龄日龄图３－２猪腺病毒在各年龄层的感染情况Ｆ－ｉ３２Ｔｈｅｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｒｕｎｆｅｃｉｏｎｉｎｌｌｅｓｇ．ｉｓｉｔａａｐｇ２．６猪腺病毒感染与仔猪健康状况的关系３１８份肛口拭子分腹泻仔猪和正常的健康仔猪１６０份、健康仔猪，其中腹泻仔猪１５８份。１７３份鼻腔拭子分别为呼吸急促病猪和正常的健康仔猪，其呼吸急促仔猪８４份、健康仔猪８９份。在猪场采集样品时就说按照病猪和健康猪各半的比例来采样的，目的就说观察是否有规律，统计结果如下，肛口拭子中腹泻仔猪阳性４１份，腹泻仔猪２５１５的阳性率．６２％。健康仔猪阳性病料是２５份，健康仔猪的阳性率．８２％；鼻腔拭子中呼吸急促仔猪阳性病料１２份，呼吸急促仔猪阳性率１４．２８％。健康仔猪阳性病料６－－份．７４％。３３，３３，健康仔猪的阳性率６数据显示如图表的数据来看腹湾仔猪的阳性率远远高于健康猪，呼吸急促的仔猪的阳性率远远高于健康猪。．］广４０广３０１Ｉ□肛ｎ拭子１广一■２０Ｉ鼻腔拭子广１０Ｌ■［」ＬＩｊＪ〇腹泻呼吸急促图３－３猪腺病毒在健康猪和患病猪中的感染情况Ｆｉ－ｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓｇ．３３Ｔｈｅｏｒｃｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｈｅａｌｔｈｎｄｄｉｓｅａｓｅｄｓｗｉｎｅｐｙａ表３－３猪腺病毒在健康猪巧患病猪中的感染结果３０ 第兰韋猪腺病多重ＰＣＲ方法的应用ａｂ－Ｔｌｅ３３Ｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｉｎｈｅａｌｔｈｙａｎｄｄｉｓｅａｓｅｄｉｓｐｇ＂Ｔｈ拭子腹泻仔猪数量阳性仔猪数量巧猪阳性率１６０４１２５．６２％健康化猪数量阳性仔猪数量仔猪阳性率１５８２５１５．８２％呼吸急促仔猪数量阳性仔猪数量仔猪阳性率０８４１２１４．２８／０鼻腔拭子健康巧猪数量阳性仔猪数量仔猪阳性率８９６６．７４％２．７猪腺病毒的阳性病料的测序结果和分析选择条带清晰，明亮ＰＣ民的电泳产物回收后送到华大基因测序，所用的测序引物３－４３５３１ＮＣＢＩ为下表所示表所示，其中型和型的引物是、５型的通用引物。血清型与公布的序列同源性９１％，血清３型和ＮＣＢＩ公布的序列同源性８９％，血清４型和ＮＣＢＩ－－－－公布的序列同源性９６％，血清５型和ＮＣＢＩ公布的序列同源性９４％。如图３４３５３６３７，，，表３－４猪腺病毒的测序引物Ｔａｂ－ｌｅ３４Ｔｈｅｓｅｕｅｎｃｉｎｇｒｉｍｅｒｏｆｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｑｐ病毒引物序列产物长度ＰＡＤ１ＰＡＤ１Ｆ１ＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＴＣＴＣ５９２ｂｐＰＡＤｌ民１ＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＣＣＡＣＴＡＴＣＰＡＤＳＰＡＤ３５Ｆ１ＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴｌｌｌｂｐＰＡＤ３５民１ＣＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＫＧＣＣＴＧＴＴＧＴＰＡＤ４ＰＡＤ４Ｆ１ＧＧＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＴ７１６ｂｐＰＡＤ４艮１ＣＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＰＡＤＳＰＡＤ３５Ｆ１ＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴ７７７ｂｐＰＡＤ３５民ＩＣＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＫＧＣＣＴＧＴＴＧＴ３１ 湖南农业大学硕±（全日制专业硕±）学位论文ｎｋ‘＂：ｒａｐｈｃＲ丹ｎ〇ｅ１＇：９７５ｔ．ｏ１５２ＳＧｅｎ白ａＧｉｓ寺ｒ八娩無ＳｃｏｒｅＥｘｐｅｃｔｒ占ｅｎｔｉｔｉｅｓＧａｐｓＳｔｒａｎｄ７５０ｂｌｔｓ４０６１２？／ｌｕｉｕｓ（）５／５６２（〇）玉２／５６之（２％）Ｐｓ／Ｐ＿Ｑｕｃｅｒｙ４ＣＴＣＴＩＣＴＴＣＴＣＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴＯＴＧＡＧＣＴＪＴＡＣＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＡＧＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣ６３ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌｌｌｌｉｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌｉｍＳｂｊｃｔ９７５ＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧ夫祐ＴＧＴＡＣＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＡＧＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＣＴ１０３４ＣＣＣＴＣＧＣＧＴＣＣＡＯＴＴＴＣＴ？５ＴＣＣＣ；ＣＣＱｕｅｒｙ６４ＴＣＡＣＡＴＡＧＡＡｔＧＣＴＧＡＣＴＣＴＴＡＣＴＣＧＣ＜３ＣＴＣＴ２３／ＡＣＴ１ｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉ！ＩＩ！ｉｉｍｉｉｉｉｉｎｎｉｉｉｉｉｉｍｉ－ＳｂｉＧＡＣＴＣＣ＾ＧＣＴＣＧＧＯＣＴＣＴ１０８８ｊｃｔ１０３５ＴＣＣＣＣＴＣＧＣＧＴＣＣＡＯＴＴＴＣＴＧＡＡＣＧＡＧＡＴＡＧ／ｔＡＣＣＧＱｕｅｒｙ１２４ＧＧＣＴＣＴＧＣＯＯＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴＴＯＡＧＣＣＧＯＣＴＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＡＣＧＡＡ．１８３ｉｉＭｌＩＩＩｉｉｉｉｉＩＩＩｉｍｉｉｉｌｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｌｉｉ１ｉｉｉＭｉ—－ＧＡＴＴＴＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＣＣＡＡＡＣＧＡＡＳｂｃｔ１０８９ＧＧＣＴＣＴＧＧＡ．ＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡ１１４５ｊＱｕｅｒｙ１８４ＧＡＣＡＴＴ〔Ｔ／ｔＧ＜；ＣＡＧＣＡＴＡＧＴ〔ＡＴＣＡＡＣＡｉＷ：ＣＡＧＡＴＣＧ＜５０ＣＣＣＡＡＧＷｒ〔ＣＴ＜３＜；ＣＣＣＴｆ？＜５０Ａ２４３ＭｉｌｌｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉＭｉｍｉｉｉｍｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｍｍｉｉｉｉＳｂ＜ｊｃｔ１１４６ＧＡＣＡＴＣＣＴＡＧ．＜３ＣＡＧＣＡＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡ；Ｕ；ＣＡＧＡＴＣＧ＜？＜５ＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴ＜３？ＣＣＣＴＧ＜ｊＧＡ１２０５Ｑｕ？ｒｙ２４４ＴＡＣＧＴＣＴＡＴＧＣＣＧＣＣＧ０３ＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣ３０３ｍｉｉｍｍｉｉｍｉｍｍｍｍｍｍｍｉｍｍｍｉｍｉｍｍＳｂｃｔ１２０６ＴＡＣＧＴＣＴＡＴＧＣＣＧＴＣＧＯＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣ１２６５ｊＱｕｅｒｙ３０４ＴＡＣＴＡＴＣＧＣＣＯＣＴＡＣＧＴ＊ＳＣＴＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣ＜＞ＴＧＣＡＯＣａ：ＣＡＧＡＴ＜＜；ＴＣＪＴＣＣＴＣＣ３８３ｍｉｌｌｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ！ｉｉＳｂ＇ｊ１２６６ＴＡＣＴＡＣＣＧＣＣＱｒＸ：ＧＴ３ＣＴ（５ＧＣＣＡＣＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＧＴＧＣＸＧＣＧＣＣＡｃ；ＡＴＧＴＧＧＴＣＣＴＣＣ１３２５ｃｔＡＸ－Ｑｒｙ３６４ＧＡＧＯＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＧＯＯＯＣＣＡＣＣＯＴＣＧＴＧ＾ＪＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＡＡＧＴ４２２ｘｉ？ＩＩＩＭＩＩＩＩｉｌｌｉｌｌｉｉｉｉｉｉｍｍｉｌｌｍｉ１１ｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉＳｂｔ－ＴＧＣＧＧＡＡＡＷｃ１３２６ＣｒＡＧＧＣＣＣＴＣＣ：ＣＴＴＣＴＣＧＯＣＣＡＪｒＡ．ＯＴＣＡ．ＴＧＣＴＴＡＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＴ１３８４ｊＴＣＧＣＴＴＣＯＡＧＧＡＧＡＴＧ＜Ｑｕ？ｒｙ４２３ＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧ３ＴＯＴＴＣＴＡＣＴＡＪ：ＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴ４８２ｉｍｉｌｉｌｉｉｌｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｌｉｍｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｍｉｃｔ＜Ｘ：Ｓｂｊ１３８５ＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧＡＴＧＯＴＧＴＴＣＴＡＣＴＡＣ／ａ：ＡＡＣＣＴＣＣＧＴ１４４４Ｑｕ？ｒｙ４８３ＣＴＴＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＯＴＧＯＯＴＯＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴ＇ＳＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＴＣＣＧＣＣＴＧＯＣＣＡＡＣＴＧ５４２ｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉＭｉｉｍｉＳｂ１４４５ＣＴＴＣＡＴ？３０ＣＣＣＴＧ０ＴＧ＜３０ＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＣＣＡＡＣＴＧ１５０４ｊｃｔＱｕ？ｒｙ５４３ＯＡＴＡＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＡＧ５６４ｉｉｉｉｉｍｉｉＩＩｌｉｉｉｍＳｂ－ＴＧＣＣＣＡＧｊｃｔ１５０５ＧＡＴＡＧＴＧＧＡＣＣＡＧＡ１５２５－４血清图３１型的比对结果－Ｆｉｇ３４Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｓｅｒｕｍｔｙｐｅ１＊■Ｒａｎｇｅ１：１９２５８ｔｏ１９９９８ＧｅｎＢａｎｋＧｒａｐｈｉｃｓＭａｔｃｆ令瓜仁ＳｃｏｒｅＥｘｐｅｃｔＩ＾Ｕｉｄ＜ｌｃｎｔｅｓＧａｐｓＳｔｒａｎ９０５ｂｉｔｓ４９００．０３１７４６４％ＰｔｕｓＰｌｕｓ（））／（）／＾弓皂Ｚ７—弓ｆ為－ｔＡＡＧＴＧＡＣＧＡＣＧＯＡＧＣＧＣ了ＣＧＣＡＧＣＧ＜＾ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧＴＣＣ〔ＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＱｘ？ｘｙ５〔Ｇ＿６４１１ＩＩ１１川ＩＩＩＭｌｍｍｍｉｌＩＩＩＩＩＩＩＩｍｍ川ＩＩ１１ＩＩＩ！ｍＩｍＩＳｂｃｔ１９２５８ＣＧＡＴＧＴＧＡＣＯＡＣＯＯＡＧＣＧＣＴＣＧＣＡＧＣＧＯＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＯＣＴＴＣＧＴＣＣＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＸ１９３１７ｊＱｕ？ｒｙ６５ＧＯＡＣＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡＣＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＴＴＣＣＡ？５ＣＴＧＯＣＧＯＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＧＴＧＴＴ１２４ｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉＭｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｍ＜Ｓｂｊｃｔ１９３１０ＧＧＡＣＷ：ＴＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＯＣＧＪＴＧ＜；ＯＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＧＴＧＴＴ１９３７７＜＜１２５ＧＧＡＣＡＴＧ＜；ＣＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣ了了ＴＧＡＣＡＴＣＣＧ３＜；ＯＡＡＣＧＣＴＧＧＡＣＣＧＧＸＪＡＣＣＣ了ＣＣＴ了〔从１８４ＭｉｉｉｉｉｉｍｍｉｍｉｉｉＭｉｉｉｉＭｉｉｉｉｉＭｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉＭｉＭＭｉｍｉｉｉＳｂｃｔ１９３７８ＧＧＡＣＡＴＧ＜；ＣＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＯＯＯＡＡＣＧＣＴＧ＜ＪＡＣＣＣ＜３ＣＯＡＣＣＣＴＣＣＴＴＣＡＡ１９４３７ｊＱＴｉｅｒｙ１曰５ＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧ＾＜３ＣＡＣＣＧＣＧＴＡＣＡＡＴＡＴＣＡＴＧ＜；ＣＴＣＣＣＡＡＧＡ＜３ＣＧＣＴＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴＣＡ２４４ｉｉｍｉｉＭＭｉｍｉｍｉｍｉｉｉｉｉｉｍｉｉｍｍｍｉｉｉｍｍｉｉｍｉｉＳｂｊｃｔ１９４３８ＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＧＯＣＡＣＣＧＣＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＯＣＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＧＣＴＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴＣＡ１９４９７Ｑｕ？ｘ－７２４５ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧ３０４ｉＭｉｍｉｉｉＩＩＩｉｉｉｉｉｉＨｉｌｌＩＩｉｉｉｉｍｔｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉＩＩＩＩＩＩＩＩＳｂｊｃｔ１９４９８ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＡＡＡＯＯＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＯＣＴＧＧＣＡＡＡＯＴＴＡＡＴＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＡＧＣＡＡＯ１９５５７５５５ＣＡＣＴＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＡＣＧ３ＪＡＧＡＣＡＴＴＧＡ－－Ｑｕｅｒｙ３０５ＴＴＴＴＧＴ？ＳＡＴＴＣ〇ＡＡＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡ３６２＜＜＜＜＜ｌｌｌｌｌｉｍＩＮＩＩＩＩｉｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌＩＩＩＩＩＩＮＩｉｌｌｉｌｌｌ１９５５８ＴＴＴＴＧＴＧＧＯＴＣＣＴＡＴＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＧＯＯＡＧＡＣＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＷ－－ＳｂｊｃｔｖＧＡＡＧＡＡＯＡＣ１９６５１－——Ｑｕ？ｒｙ３６３ＡＡＣＧＡＧＣＣＣＡＴＣＧＡＴＡＣＴＴＣＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＣＷＵＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＡＪｋＧＣＴＣＧＴＧＧ＾４１９ＭｌｉｌｌｉｌｌｌｌｌｌＩＮｌｌｌｌｉｌｌｌｌｌｉｌｌｉｌｉｌｌｌｌｌｌＭｉｌｌｌｌＭｌｉｌｌＳｂｊｃｔ１９６１６ＣＪＡＡＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＡＴＣＣＴＴＴＧＴＡＴ＜５ＡＧＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＴＧ＜ＪＴＣＣＡＡＣＣＴＣＧＴＧＧ１９６７５＞．＜＇Ｑｕ？ｒｙ４２０ＴＣＡＧＡＣＡ．ＴＡＴＡＣＣＴＴＣＴＣ：ＣＧＡＣＴＡＧＣＧＣＡ３ＣＣＧＧＡＡＧ０３ＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＣＡＣＡ３４７百ＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩ１ＩＩ１ＩＩＩＩＩＳｂｃｔ１９６７６ＴＣＡＧＡＣＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＴＡＧＣＧＯＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＧ１９７３５ｊＱｕ？ｒｙ４８０ＣＧＴＣＡＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＯＴＴＣＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＣＣＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＣＡＡＧＯＣＧＧＡＣＡＡＡＣＯＡＡＧ５３９ＭｉｍｍｉｍｍｍｉｍｉｉｍｉｍｉｉｍｍｍＩＩｉＭｉｍｉｉ—＜＜Ｓｂｊｃｔ１９７３６ＣＧＴＣＡＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＴ成ＣＴＣＴＣＣＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧ５ＴＧ＜５３ＣＡＡＡＣ１９７９２Ｑｎ＊ｒｙ５４０ＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＡＴＧＴ了ＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＴ〔ＣＣＧＡＴＡＣＴ＿Ａ－ＧＡ－成－５９２ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｌｌｌｌｌｉｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉＩＩＩＩＩＳｂ１９７９３ＡＡＧＧＡＴＪＡＣＡＡＧＯＴＴＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡ＜３ＣＡ１９８５２ｊｃｔ（ＡＣＴＴ图３－５血清３型的比对结果－ｍＦｉ３５Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏａｒｅｄｔｏｓｅｒｕｍｔｅ３ｇｐｙｐ３２ 第Ｓ章巧腺病多熏ＰＣＲ方法的应用ＳｃｏｒｅＥｘｐ化ｃｒｌ：ＩｄｅｎｔｉｌｉｅｓＧｏｐｓＳｉｒ讶ｉｉｄ１ｔｓ（．０６４５／６７４（９６Ｖｃ〇）ＰｕｓＩｌ．．９？弓—皆导Ｓ今）—与互今｜／Ｐ＜－Ｑ＜ｕ？ｒｙ１ＣＴＧＴ＜３＜５３０ＴＧ５ＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＯＧＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＧＴＧ＜；ＣＴＴｊＭ：ＴＴＧＧＡＡＣＡＴＡ５９ＩＩ！ｉｉｉｉｉｌｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｍＭｌｌＩ］ＩＩＩｉｉｉｉｉｉ１１ＩＩ１１ＩｉｉｉｉＳｂ－Ｃ＜ｊｃｔ１６６９ＣＴＯＴ３ＣＯＴ５ＧＯＳＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡＯＡＡＧＯＣＴＣＡＴＧＡ０３ＣＯＴＯＡＣＴＴＡＣＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡ．１Ｔ２７－３＜Ｘ－Ｑ６０ＡＡＡＣＣＴＴＧ；ＣＴｔ５０ＴＣＴＧＴＴＡＧＣＴＧＡＴＡＴＡＡＣＣＡＣＣＡＴＧ＜；ＡＴＧＴＣＴＴＧ０ＡＴＣＧＣＡＴＴＣ１１８ｕ？ｒｙ＜！ＩｉＩＩＩ１ＩＩＩｔＩＩＩＩＩＩＩＩ１Ｉｉ）ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩＩ１ＩＩＩｃｌ（？＜＜＜Ｓｂｊ１７２８ＡＡＡ￡：ＣＴＴ５Ａ５５ＣＴ＜；ＣＣＣＴＪＴＴＡＡＣＴＧＡＴＡ．ＴＡＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＣ５ＣＡＴＴＣ１７８７Ｑｕｅｒｙ１１９ＴＧＯＣＷＡＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＴＴＧＡＧＯＣＡＣＴＴＧＯＴＴＣＡＧＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴ１７８ＩＭｉ１１Ｉ１１ＩＩ１１ＩＩＩＩＩＩＩｉｉＩＩ１ＩＩＩＩＩｉＩｉＩＩＩＩｉＩＩ１１ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉ１１ｉ１ＩＳｂｊ７８ＳＴＧＧＣＧＯＡＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＴＴＧＡＯＫ：ＡＣＴＴＧＯＴＴＣＡＧＣＡＧＡＣＧＯＣＣＡＡＧＯ＜３ＣＣＴＣＴＣＣＴＯＯＴ１８４７ｃｔ１＜－ＳＱｒ１７９ＧＣ＾ＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣ＾３＜Ｋ：ＴＣＧＯＣＡＴＴＧＴＴＧ＜ＪＴＣＡＣＣＴＴＧＯＡｊ．ＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＧＧＧＡＡＣ２３８ｕＡＸｊＭＩＮＩｌｌｌｉｌｌｌｉｉｌｌｉｌｌｌＩＩＩＩＩ１ＩＩＩＩＩｉＩＩＩｉＩＩＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ－ＳｂＩＣＴＡＣＣＴＧＴＧＯＯ＜．；ＴＴ＜！ｊｃｔ１８４８ＧＯＣＡＣＣＫ：ＴＣＡＴＣＡＴＴ；ＯＴＣＡＣＣＧＴＧＯｊＵＩＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＧＧＯＡＡｊＣ１９０６２３９ＡＣＧＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＷＴＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣｔＡＴＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧ２９８ＩＩＩＩＩＩＩＭＩＩＩＩｉＩＩＭＩ１ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ（ＩＩＩ１ＩＩＩｉＩＩｃｔＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡ６６Ｓｂｊ１９０７ＡＣＯＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＴＧＪＡＧＣＴＴＴＴＧＡＣＣＷＡＧＣＧ１９Ｑｕｅｒｙ２９９ＧＴＧＡＣＣＣＴＡＣＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＧＣＣ３５８ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩ１ＩＩ１Ｉ１ＩＩｉ１ＩＩＩＩ！ＩＩＩｉＩＩｉＩＩＩＩＩｉ１ＩＩＩＩＭＩＩＩＩＩＩＩＳｂ＜ＪＡＣＣＣＴＡＣＴＧＣＯ＜５ＴＴＴＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＣＣＣＯＴＧＯＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧｊｃｔ１９６７ＧＴ＜５ＡＣ２０２Ｓ－ｒ＜＜＜Ｑｕｔｘｖ３５９ＡＣＧＴＧＴＴＧＡＣＡ３ＧＡＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴ３ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧ＜ＴＣＣＧ＜Ｋ：ＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴ５ＣＡＣＴＣ４１百ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ１ＭＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩＭＩＩＩＩＩ！ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｔｃＳｂｊｃ２０２７ＡＣＧＴＧＴＴＧＡＣＡＡＣ了ＡＴＴＣＣＴＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＡＣＣＴＷＴＣＣＸＩＣＧ了ＴＯＣＡＧＣＡＴＴＷＴＡＣＴＣ２０８６Ｑｕ？ｒｙ４１９ＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＯＳＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡ４Ｔ０ｍｍＩＩＩＩＭｍ１１ＩＩＩｍＭｌＩＭｌＩＩＮｍＩＩＩＩ１１１１ＩＩＩ１１川ｍＩＩＩＩＳｂｊｃｔ２０８７ＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＣ？ＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＡＴ＜？＜３ＣＴ＜ＪＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡ２１４５－７９ＧＡＧＡＣＧＣＣＴＴＴＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣ＜３０Ａ＜Ｑ＜５３ＣＣＡＴＣＣＳ３百ｕｅｚｖ４ＡＣＣＴＣＧＣＣＡ０ＡＴＴＴＣＴＣＣＣＴＧ０ＡＧＡＣ１ＩＩｉｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ１１ＩＩＩＩｉ｛ｔＩＩＩＩＩＭＩｉＩＭｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ！１ＩＩＩＩｉＩＩ１Ｓｂ２７ＯＡＧ－ＡＣｔ５ＣＣＴＴＸ：ＣＡＣＧ〇！ＵＴＣＧＣＣＡＯＡＴＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＯＡＣＧＣＣＡＴＣＣ２２０６ｊｃｔ１４ＴＣＧＣＣＧＣＡＡｊｋＣＣ＜？Ａ５３９ＧＯＣＣＴＣＡＣ了了Ａ弘ＧＴＧＡＴＡＧＡＧＧＡＴＧＡ成了了了＜Ｘ＜？ＡＣＧＯＣＡＡＴ〔５９８；ｉＩＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩｉ！ＩＩｉｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩＩＩＩＭＩＩ１ＩＩＩｉｔＩＩＩＩＩｉＩｉＩＩＩＩＩｉＩＩｃｔ２２０７ＧＣＣＣＴＣＡＣＴＴＡＧＡ？＜Ｓｂｊ＜ＪＴＧＡＴＡＧＡＧＯＡＴＧＡＧＣＴＧＯＣＯＯＡＧＡＴＧ＜；ＡＧＡＧＡＣＴＧ３０ＡＣＧＯＣＡＡＴＣ２２６６？ＣＡ３Ｃ？０ＣＴ？＜３０Ｑｕ？ｒｙ５９９＜＜＜ＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴＴＧ＜ＡＴＧＣＧＣＧＡＣＣＣＴＧＷｒＣＴＧＡＴＴＴＧＧＡＧＴ了ＴＴＧ６５８ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＭＩＩ１Ｉ１ＩＩＩＩｊＩｉＩＩＩｉｔ１ＩＩＩＩＩＩＩＩＭＩＩＩＩＩＩＭＩＩ！ＩＩＩ！ＩＩＳｂｊｃｔ２２６７＜５ＣＡＧＣＧ＜３ＣＴＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴＴＧＧＡＴＧＣＧＣ＜５＜ＷＡＣＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＴＴＴＧＯＡＧＴＴＴＴＧ２３２６国３－６血清４型的比对结果Ｆ－ｉｇ３６Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｓｅｒｕｍｔｙｐｅ４ｔｎＫ啤内运．Ｋａｎｅ义ｇＪＬ：上〇〇４ＴＯＪＬ＇ｊｅｎａａｋｊｒａｐｎｉｃｓｘＳｃｏｒｅＥｘｐｅｃｔＩ台ｅｎｔｉｔｉｅｓＧａｐｓＳｔ：＇。、１０２７ｂ－ｉｔｓ（５５６）６／６８９Ｃ４／８６Ｓ９ｌＰｌＰ／ＣｌＰ—皂弓弓？）Ｑｎｅｒｙ１ＴＧＡ－ＣＡＣＧＧＡＧＣＧＴＴＣＧＣＡＧＣＧ３ＣＴ＜５ＴＴＴＧＴＧＣＣＧ＜５ＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡ５９＜ＡＣＡＧＣＴＧＣＧＩＮＩＩｉＩＩ１Ｉ！ｉＩＩｉｉＩＩｉＭＩＩｉＩＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩ１ＩＩＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ１ＩＩＩＩＩＩＩＳｔｊｃｔ１６６１４ＴＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＴＴＣＧＣＡＧＣＧＯＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＣＣＧＯＴＧＯＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡ１６良７３＜Ｑｕｅｒｙ６０ＣＧＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＡＡＧＡＣＧＡＧＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧ＜３ＣＧ＜ＪＴＴ５ＧＣＧＡＣＡＡＣＡＧ＜ＷＴＧＣＴＧＧＡＣＡ１１９ＩＩＩ１１１１ＩＮ川１１Ｍｍ１１１ＩＩＩＭｌ１１１１１川１１川１１ＩＩＭｌ１１Ｉ川ｍ１１ＳｂｃｔＣＧＡＧＧＴ了ＣＣＡＧＣ了Ｇ＊３ＣＧＧＴ了ＧＧＣＧＡＣＡＡＣＡＧ＜３ＧＴＧＣ了ＧＧＡＣＡｊ１６６７４〔ＧＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＡＡＧＡ１６了３３ｉ１２０ＴＧ３ＣＣＡ０ＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＧＡＥＡＴＴＣＧ０＜３０ＧＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＧＡＧ＜３ＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＣＴ１７９Ｑａｅｒｙ＜ＩＩ川ｍＩ１１１川１１１１ＩＩＩＩＭＩＩＭｌＮ川ｍｍＩＭ１１川ＭｌＩＮＭＭｌＳｔｊｃｔ１６Ｔ３４ＴＯ？５ＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＣＧ？３＜３Ｇ＜；ＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＧＡＧＯＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＣＴ１８７９３Ｑｕｅｒｙ＊ＡＡＴＡＡＣＡＣ１８０ＡＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＧＴＣ／ｔＭＧＴＴＴＧ２３９１１１１ｍ１１Ｍｉ川１１１１１ＩＩＩＭｍ１１１１１ＭｉＭＩＩＩＩｍＩ川１１Ｍ１１川１ｃｔ＜ＣＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＧＣＳｂｊ１６７９４ＡＣＡＧＣ３ＣＣＡＣ＜５ＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＴＣＣＧＴＣＡＡＴＡＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＯＸ艮８５３Ｑｘｉｅｊｒｙ２４日ＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＡＡＧＯＴＣ从ＴＧ＜３Ｃ＜；ＣＡ＾ＧＧＣＴＴ〔了了了了ＧＣＡＡＣＡＣＣＣＡ２９９ＩＩＩ川１１ＭｍＩ！ｍ川Ｍｌ１ＩＭＩ１１１１１１１１１１！Ｍ１１Ｍ１１ＩＩＩ１１１ＩＩＩＩＩ１Ｓｂｊｃｔ１６８５４ＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＡＡＧＯＴＣＧＡＴＧＯＣＧＣＡＧＯＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＡＣＡＣＣＣＡ１６９１３Ｑｕｅｒｙ３００ＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣ３５９ＩＩＩＩＩ１ＩＩＩ１ＩＩＩｉＩＩＩＩ１ＩＩＩＩＩＩＩ１ＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｉ１ＩＩＩＩＩＩＩＳｂ１６９１４ＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＡＧＯＴＧＣＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣ１６９７３ｊｃｔ＇Ｑｕｅｒｙ３６０ＣＣＧＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＧＧＴＡＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡＴＡ＜ＪＡＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧ４１９１１１ＭｌＩＩＮ１１１ｍｍＩＩＩＩＩ１１ｍ１１川ｍＩＩＩ！Ｍ１１Ｍｌ１１川ｍＩＩＩｉＳｂｊｃｔ１６９７４ＣＣＧＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＴＧＯＴＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧ＜３０ＴＡＴＣＴＧＡ．ＴＧＴＴＡＴＡＯＡＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧ１Ｔ０３３Ｑ－４２０ＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＧＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＣＴＡＡＣＡＡＴＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＴＧＣＧＡ４Ｔ９ｔｉｅｚｘｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｌｉｉＭｉｉＭｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｍｉｉｉｉｉＳｂｊｃｔ１７０３４ＣＣＧＣＴＧＧＡＡ＊３ＴＡＧＴＧＣＴＡＡＣＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴＡＣｃ３ＧＴＴＣＴＴＡＴ０ＣＧＡ１７０９３ＯＡＴＴＣＴ．ｌ＜ｃＱｕｅｒｙ４８０ＧＡＣＣＡＡＣＧＯＡＧＣＡＡＡＡＴ？３ＧＡＡＧＡＣＡＧ３ＣＣＡＣＡＡＣ３４３ＣＣＧＴＴＴＡＡＧＴＧＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴＣＣＡ．５３９ＩＩＩ！ｉＩｉｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌｌＩＩｌＩＩＩ１ＩＩｌｌｌｌｉｉｉｌＩＳｂｃｔ１－１ｊ下０９４ＧＡＣＣＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＡ７１５２Ｑ＼ｉｅｚ－５４０ＧＣＡＧ－Ｃ－ＣＴ０ＴＴＴＧＣＴＧ＜ＪＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＡＣＡＧＧＡＴＴＴＧＴＣＡＴ５０－ＣＴＧＡＣ５９＆Ｖ（ＡＡＧＡＧ０ＴＴＴＧ图３－７血清５型的比对结果－Ｆｉ．３７Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｓｅｒｕｍｔｙｐｅ５ｇ３３ 湖南化业大学硕±（全ｎ制专业硕±）学位论文２．８讨论通过检测湖南，发现每个检测到的城市都有猪、江西、江苏王省的部分地区的样品７一一腺病毒阳性，涉及到的８家养殖场中有家检测到猪腺病毒阳性，并检测了些全国些地区的送检样品（肠道），都不同程度检测到猪腺病毒，说明在中国猪腺病毒分布较广，感染率也较高。猪腺病毒目前已知的血清型有５个血清型，分别血清１型、２型、３型、４型和５型，目前ＮＣＢＩ上ＧｅｎＢａｎｋ数据库中找到四个血清型的序列，只有血清１型、血清３型、血清４型和血清５型，所Ｗ猪腺病毒多重ＰＣＲ方法是基于这４个血清型建立的。通过检测猪的器官发现猪腺病毒血清３型在肠道中检出率最高，猪腺病毒血清４型在肺脏和鼻腔拭子中检出率较高。通过检测患病猪群和健康猪群相比，患病猪群的阳性率高于健康猪群。猪腺病毒多重ＰＣＲ方法较之前的诊断方法，猪腺病毒分离方法费时、费力、假阴性，，直接免疫巧光实验、琼脂免疫扩散试验并不适合病毒的快速分离、血凝抑制和病毒中和试验这些方法价格昂贵，实验条件相对苛刻，不适合临床大规模检测，近几年猪腺病毒ＰＣＲ的方法的建立与开发解决了Ｗ上这些不足，不过国内外ＰＣ民方法目前只是检测出猪腺病毒血清３型和５型，本研究建立猪腺病毒多重ＰＣ民方法同时检测鉴定猪腺病毒血清１、３、４、５四种血清型，效果良好，方法稳定有效。２．９结论１．本研究建立猪腺病毒的多重ＰＣＲ方法，建立同时检测猪腺病毒四种血清型的快捷一方法，为进步研究腺病毒流行情况作技术上的有力支撑，为大规模的流行病学调查提供技术手段。２．相比单重ＰＣ艮方法，多重ＰＣＲ较之前更加快捷和方便，跟目前对猪腺病毒的诊断手段主要为电子显微镜观察、感染细胞的免疫炎光、免疫组织化学染色检测病毒抗原检测、血凝中和实验、琼脂免疫扩散实验相比，猪腺病毒多重ＰＣＲ方法更加快捷，实验成本大大降低。３４ 参考文献参考文献１艮ｏｗｅＷＰＨｕｅｂｎｅｒ民ＪＧｉｌｍｏｒｅＬＫｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｃ化ａｄｉｏｅｎｉｃａｅｎｔｆｒｏｍｈｕｍａｎａｄｅｎｏｉｄｓ，［］，，ｙｐｇｇ－ｕｎｄｅｒ呂ｏｉｎｇｓｏｎｔａｎｅｏｕｓｄｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅＪ．ＰｒｏｃＳｏｃＥｘＢｉｏｌＭｅｄ．１９５３８４３：５７０５７３．ｐ呂［］ｐ，（）ＰｕｌｍｅｒＷＳＴｓａｉＫＳＵｔｌｅＰＢ．ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｔｗｏｃａｉｖｅｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ比ｅＡｍｅｒｉｃａｎ］Ｂ，，［］ＶｅｉＭｅｄｉｃａｌｉｔｉ．６６３２３３．ｔｅｒｎａｒＡｓｓｏｃａｏｎ１９＾１：ｙ，（）３艮ｅｅｄＤＥＷｈｅｅｌｅｒＪＧＬｕｋｍＨＷ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｅ７ｆｒｏｍｃａｌｖｅｓｗｉｔｈｎｅｕｍｏｎｉａ［］，，ｐｙｐｐａｎｄｅｎｔｅｒ－ｉｔｉｓ．ＡｍＪＶｅｔ民ｅｓ．１９７８３９（１２：１９６８９７１．＂１］，）４ＷｒｉｈｔＮＧＴｈｏｍｓｏｎＨＣｏｒｎｗｅｌｌＨＪ．ＣａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｎｅｕｍｏｎｉａＪ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｖｅｔｅｒｉｎａｒｓｃｉｅｎｃｅ．［］ｇ，ｐ，ｐ［］ｙ１９７１１２２：１６２．，（）民ｕ＇５ｓｓｏＰＬａｍｂｅｒｔＭＧｉａｕｆｆｒｅｔＡ．ＩｓｏｌｅｍｅｎｔｃＴｕａａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｃｈｅｚｕｎａｎｅａｕａｔｅｉｎｔｄｅｎｔｅｒｉｔｅ’ＢｕＵｅｔｉ打．［］，，ｇｙ］１９７８．６ＡｒｄａｎｓＡＡＰｒｉ化ｈｅｔ民ＦＺｅｅＹＣ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａ打ｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｕｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＪ．Ｉ打ｆｂｃｔ［］，，ｑｆ］－Ｉｍｍｕｎ．１９７３７４：６７３６７７．，（）＊７ＢｏｄｏｎＬ和ＰＬ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｆｒｏｍｉａｂｂｉｔｓｗｋｈｄｉａｒｒｈｏｅａＪ．ＡｃｔａｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａＡｃａｄｅｍｉａｅ［］［］ＳｃｉｅｎｔｉａｒｕｍＨｕｎｇａｒｉｃａｅ．１９８１２８３：２４７．，（）８ＣａｒｌｓｏｎＨＣＡ＾ＳｈｅｉｋｈｌＦＰｅｔｉｔＪ民ｅｔａｌｉｒｔｉｃｌｅｓｉｌＩｎｔｉｋｉ］．ＶｒｕｓＰａｎＳｅｅｎｓａｎｄｅｓｔｎｅｓｏｆＴｕｒｓｗｔｈ，巧［，ｙ，ｐＨｅｍｏｒｒｈａ－ｇｉｃＥｎｔｅｒＵｉｓＪ．ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ．１９７４１８１：６７７３．［］，（）９ＳｏｎＤＨｕａｎＤＰｅｎｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｈｌｏｅ打ｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｏｒｃｉｎｅ［］ｇ，ｇ，ｇＱ，ｐｙｇｙｐｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｅｓａｓｓｏｃａｔｅｄｗｉ化ｏｕｔｂｒｅａｋｓｏｆｓｅｖｅｒｅｄｉａｒｒｈｅａｉｎｉｌｅｔｓｉｎｉａｎｘｉｃｈｉｎａ２０１３Ｊ．ｐｉｐｇｊ呂，［］ＰＬｏＳＯｎｅ．．２０１５１０３：ｅｌ２０３１０，（）ｙｏ］ＨａｉｇＤＡＣＭＣＰ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｆｒｏｍａｐｉ呂［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａ］ｏｆＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＰａ化ｏｌｏ呂ｙ．１９６４，７４：－８１８４．［１１］ＫａｓｚａＬ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｆｒｏｍｔｈｅｂｒａｉｎｏｆａｐｉｇ［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｒｅｓｅａｒｃｈ．１９６６２７１１８）：７５１．，（．１２艮ＤＪ．Ｔｈｅｉｎ化ｒｆｅｒｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄｏｒｃｉｎｅｖｉｍｓｅｓＪＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅ化ｒｉ打ａｒＲｅｓｅａｒｃｈ．［］ｙｐ［］ｙ９８９．１１３ＫａｓｚａＬＨｏｄｅｓ民ＴＢｅｔｓＡ０ｅｔａｌ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｉｎｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃｉｓｒｏｄｕｃｅｄｂｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ［］，ｇ，，ｇｐｇｐｙｉｆ－ａｄｅｎｏｖｉｄｍｌｈｉ．．．ｉｎｏｃｕｌａｔｏｎｏｓｗｉｎｅａｒｕｓａｎｃｏａｓｍａｏｎｅｕｍｏｎａｅ［ＪＶｅｔ艮ｅｃ１９６９８４１１：２６２２６７ｙｐｙｐ，］（）ｌｉｌｉ１４ＰｒｉｎｌｅＣ民．Ｔｈｅｕｎｉｖｅｒｓａｓｓｔｅｍｏｆｖｒｕｓｔａｘｏ打ｏｍｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａＣｏｍｍｔｅｅｏｎＶｉｍｓＴａｘｏｎｏｍ［］ｇｙｙｙＩＣＴＶｉｎｃｌｕｄｉｎ打ｅｗｒｏｏｓａｌｓｒａｔｉ巧ｅｄｓｉｎｃｅｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔ：ｈｅＳｉｘｔｈＩＣＴＶ民ｅｏｒｔｉｎ１９９５ＪＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆ（）．，ｇｐｐｐｐ［］Ｖ－ｉｒｏｌｏ．１９９８４３１２０３２１０．ｇｙ１：，（）ｌＭ．ｉｉｉｉｔ．ｆｅｃｉ．１引ｖａｎＲｅｅｎｍｏｒｔｅＭＨａｈ良ＷＥｍｅｒｎｓｓｕｅｓｎｖｒｕｓａｘｏｎｏｍＪＥｍｅｒＩｎｔＤｓ２００４ｌＯ：，［］，［ｇｙｇｇｙｇｙ）８－１３．６ｌａｒｋｅＭｒｅＨ良ＤｅｒｂｓｈｉｒｅＪＢ．Ｓｏｍｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｒｅｅｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｍｓｅｓ．ｒｃｈ１ＣＣＳｈａＪＡ［］，ｐ，ｙｐ［］Ｇ－ｅｓａｍｔｅＶｉｕｓｆｏｈ．１９６７２１１９１９７．：ｒｒｓｃ：，（）ｂｈｉｌｌｉ．ｉｌｉｉｄｉｅｌ１７ＤｅｒｓｒｅＪＢＣａｒｋｅＭＣＣｏｌｎｓＡＰＳｅｒｏｌｏｃａａｎｄａｔｈｏｅ打ｃｔｓｔｕｓｗｉｔｈｓｏｍｅｕｎｃａｓｓｉｆｉｅｄ［］ｙ，，ｇｐｇｙｏｒｃ－ｐｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓＪＣｏｍＰａｔｈｏｌ．１９７５８５：４３７４４３．［叮ｐ，口）１ａＭＮａＥＴｕｂｏｌＴ．Ｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｒｕｓｓｅｒｏｔｅ５Ｊ．ＧｅｎｏｆｉＪ［引Ｎｇｙ，ｇｙ，ｙｐｑｐｙｐ［］ｉ－Ｖｒｏｌ．２００８２５２乂１Ｐｔ３：５２５，（）．１９ＫａｄｏｉＫＢｅｎｅｆｉｃｉａｌｕｓｅｏｆｉ打ａｃｔｉｖａｔｅｄｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅａｎｄａｎｔ化ｏｄｒｅｓｏｎｓｅｏｆｏｕｎｉｓ．［］ｐｙｐｙｇｐｇ口］ＮｅｗＭ－ｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７２０１：８９９Ｌ，（）３５ 湖南农化大学硕±－丄－（全日制专业硕）学位论文２０ＫａｄｏｉＫＩｗａｂｕｃｈｉＭＳａｔ：ｏｈＴｅｔａｌ．Ａｄｅ打ｏｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｉｏ打任ｏｍｓｌｅｅｎｌｍｈｏｃ化ＳｏｆａａｒｅｎｔｌｈｅａＵｈ［］，，，ｐｙｐｙｐｐｙｙ－ｐｉｇｓＪ．ＮｅｗＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７２０３；２１５２２０．［］，（）－２．．．２００６２．］李瑞江，黄伟竖，陈琼，等从发病仔猪呼吸道检测出猪腺病毒Ｊ广西窗牧兽医０５：０４２０６［］［］（）２２Ｄｅｒｂｓｈｌ．ｉｉｉｆｉｉｒｅＪ目ＣａｒｋｅＭＣＣｏｌｌｉｎｓＡＰＳｅｒｏｌｏｉｃａｌａ打ｄａ化ｏｅ打ｃｔｓｔｕｄｅｓｗｉｔｈｓｏｍｅｕｎｃｌａｓｓｉｅｄ［］ｙ，，ｇｐｇｙｏｒｃ－ｐｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｍｓｅｓｙ．ＪＣｏｍＰａｔｈｏｌ．１９７５８５３：４３７４４３．］ｐ，（）２３ＨｉｒａｈａｒａＴＹａｓｕｈａｒａＨＭａｔｓｕｉＯｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ任ｏｍ出ｅｒｅｓｉｒａｔｏｒｔｒａｃｔｏｆｉｓ［］，，，ｐｐｐｇｙ－ｉ打化ｐａｎＪ．ＮｉｈｏｎＪｕｉａｋｕＺａｓｓｈｉ．１９９０５２：４０７４０９．［］ｇ，口）２４ＴｕｂｏｌＴＲＰＮＥ．ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎａｌｓｉｓａｎｄｈｓｉｃａｌｍａｉｎＯｆ化ｅｅｎｏｍｅｏｆｏｒｃｉｎｅ［］ｙｙｐｐｐ呂ｇｐａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｅ５．Ｊ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ．１９％．ｙｐ［］２ａＭＮａ巨ＴｕｂｏｌＴ．Ｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｅ５Ｊ．ＪＧｅｎ，［引Ｎｇｙｇｙ，ｙｐｑｐｙｐ［］Ｖ－ｉｒｏｌ２００１８２Ｐｔ３：５２５５２９．．，（）［２６］ＧａｍｅｓＤＪ，Ｘｕａ打Ｈ．Ｇｅｎｏｍｅｔｙｐｉｎｇｏｆ化ｒｅｅｓｅｒｏｔｙｐｅｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ｉＭｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９８９，－３０４．：２３４２３６（）２７Ｋｋ化ｏｅｋｅｒＳＢ．Ｓｅｕｅｎｃｅａｎａｌｓｉｓｏｆｕｔａｔｉｖｅ巨３Ｖ］ＩＩａｎｄｆｉｂｅｒｅｎｏｍｉｃｒｅｉｏｎｓｏｆａｏｒｃｉｎｅ［］ｑｙｐ，ｐ，ｇｇｐａｄｅｎｏｖ－ｉｒｕｓＪ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ．１９９４３１１７２５．：１［］，（）２８民ｅｄｄＰＳＷａｍａｋａｎｔｉＮＳｏｎＪｅｔａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｍａｏｆｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ［］ｙ，，呂，ｑｐｐｐｔｅ３Ｊ－ｙｐ．Ｖｉｒｏｌｏ．１９９８２５１２：４１４４２６．［］ｇｙ，（）［２９］ＤｅａＳ，ＥｌａｚｈａｒｙＭＡ．Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆａｐｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｐｏｒｃｉｎｅｔｈｙｒｏｉｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓ．［Ｍ］．１９８４：－２０８２１７．３０ＺａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋＡＺｈｏｕＹＴ－－ｉｋｏｏＳＫ．ＡｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｌｄｅｌｅｔｅｄｏｒｃｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ３ａｓａｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎ［］，，ｐｐｖｅｃＵ）ｒ－Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏ．２００３３２：．１３３７７３８６［］呂ｙ，（）［３１］高玉伟，夏咸柱，王立刚，等．重组虎源Ｈ５Ｎ１流感病毒ＨＡ基因犬２型腺病毒的构建与实验免疫－研究［Ｊ．微生物学报．２００６０２：２９７３００．］（）３２ＬａｋａｔｏｓＢＦａｒｋａｓＪＡｄａｍ巨ｅｔａｌ．ＳｅｒｏｌｏｉｃａｌｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｃａｔｓＪ．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ．［］，，，吕［］－２０００．１４５５：１０巧１０３３，（）３３Ｔｓａ－ｉＫＳＧｒｉ打ｅｒＩＰａｎＩＣｅｔａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｒｓｔａｌｌｉｎｅａｒｒａｓｏｆｖｉｒｕｓｌｉｋｅ［］，ｙ，，ｐｙｙｔ－ａｒｉｃｌｅｓｉｎｔｉｓｓｕｅｓｏｆｍｉｎｋｗｉｔｈＡｌｅｕｔｉａｎｄｉｓｅａｓｅＪ．ＣａｎＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１１３８１４０．１９６９：ｐ［］，（）３４ＩｎｏｓｈｉＭｕｒａｋａｍｈｌｂｆｌｅｄｉｉｆｆｍａＹｉＴＩｓｉｕｒｏＮｅｔａ．Ａｎ０山ｒｅａｋｏｉａｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｏｎａｍｏｎｄｅｒｅｎｔ［］，，ｇ，呂ｏ－￣ｔａｒｉｉｄｓｐｅｄｅｓＪ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２０１３１６５３４：４５５４５乂［］，（）３５ＳｍｈｈＡＷＳｋｉｌｌｉｎＤＥ．ＶｉｒｕｓｅｓａｎｄｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｍａｒｉｎｅｍａｍｉｎａｌｓＪ．ＪＡｍＶｅｔＭｅｄＡｓｓｏｃ．１９７９［］，ｇ［］，１－７５９：９１８９２０．（）３６ＳｏｎＤＨｕａｎＤＰｅｎｅｔａＬＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａ別ｅｒｉｚａｔｉｏｎａ打ｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｏｒｃｉｎｅ［］ｇ，ｇ，ｇＱ，ｐｙ呂ｙｐｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｋｈｏｕ化ｒｅａｋｓｏｆｓｅｖｅｒｅｄｉａｒｒｈｅａｉｎｐｉｇｌｅｔｓｉｎｊｉａｎｇｘｉｃｈｉｎａ２０ｉ３Ｊ．，［］ＰＬｏＳＯｎｅ．２０．１５１０３：ｅｌ２０３１０，（）［３７］Ｄｕｃａｔｅｌｌｅ民，Ｃｏｕ巧ｅｍｅｎｔＷ，ＤｅｂｏｕｃｋＰ，ｅｔａＬＰａｔｈｏｌｏｇｙｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎ化１ＣＶ７７７ｃｏｒｏ打ａｖｉｒｕｓｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎ－ｐｉｇｌｅｔｓ．ＩＬＥｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｓｔｕｄＪ．Ｖｅ化ｒｉｎａｒａｔｈｏｌｏ．１９８２１９１：５７６６．ｙ［］ｙｐｇｙ，（）３８ｄａｒａｈＪ巨ＳＢＤ．Ａｄ州ｖｉｒｏｕｓａｓｓｏｃｄｗｉｄｉａｒｉｎｉ．．ｔ．Ｃｏｆｋ［］Ｍｃａｇｐｉａｔｅｔｈｒｈｅａｓ［Ｊ］ＡｂｓｒａｃｔＩｎ打民ｅｓＷｏｒｅｒｓｐｇＡｎ－ｉｍＤｉｓＣｈｉｃａｇｏＩＬＮｏｖｅｍｂｅｒ．１％０：１０１１．，，，ｐｐ３９ＳｈａｄｄｕｃｋＪ过ＫＫＬ．Ｔｈｅｋｓｉｏ打ｓｏｆａｒｔｉｎｅａｄｅ打ｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏ打ｉｎｅｒｍｆｒｅｅａｎｄａｔｈｏｅｎｆｒｅｅｉｓ．．［］ｇｇｐｇ［＂ｐｐｐ－５５２ＰａｔｈｏｌＶｅｔ．１９６７：５３７．－４０ＮｉｅｔｆｅｌｄＪＣＬｅｓｌｅＳ把ｅｎＰ．Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｎｅｈｒｉｔｉｓｉｎｉｓｗｉｔｈａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏ打Ｊ．ＪＶｅｔＤｉａ１１打ｖｅｓｔ．［］ｉ，ｐｐｇ［］留－１９９３５：２６９２７３．，口）３６ 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致谢致谢时间过得很快，马上就要毕业了，还未完全熟悉农大，就要离开农大，农大给我很多珍贵的回忆。感谢我的父母和妹妹的支持一，能够顺利地读完研究生，感谢他们直默默的帮助我。感谢我的指导老师尹德明老师和师母黄老师在我学习上和生活上的关也和帮助，在农大的这两年时间自己的专业水平得到了很大的提高，思维也更加开阔，离不开尹老师和黄老师的的悉也教导。感谢我的实验指导老师余老师，余兴龙老师的严格要求，仿佛回到了高中时代，余老师不仅仅在实验学术方面对我进行指导，还在为人处世方面为我提供思路，鼓励我多读书，更加深刻地了解世界和社会。感谢我校外指导老师周壁平老师在实习方面对我的指导，让我更加了解实际生产，为我的研究提供很好的临床基础。一一感谢我的室友和实验室的兄弟姐妹，跟他们在起度过了快乐时光，起探讨实验，感谢他们让我的研究生生活更加充实。３８ 作者简介作者简介姓名：李海锦性别：男籍贯：江苏盐城出生年月１９８９２；年月专业：兽医硏究方向：畜禽疫病防控Ｅ－ｍａｉｌ：主要经历：２０一２０１５１３年９月年６月就读于湖南农业大学动物医学院动物医学专业３９
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