猪伪狂犬病病毒pcr检测方法的优化建立及初步应用

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5黑龙江畜牧兽医6科技版2010年4月(上)119猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的优化建立及初步应用12111曾强,陈响坤,顾万军,黄良宗,白挨泉(1.佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山528231;2.佛山科学技术学院图书馆,广东佛山528231)+中图分类号:S852.659.1文献标识码:B文章编号:1004-7034(2010)04-0119-03关键词:猪伪狂犬病病毒;PCR检测方法;初步应用摘要:为了建立敏感性高、特异性高、重复性好的猪伪狂犬病病原的PCR检测方法,试验根据初步建立的猪伪狂犬病病毒(PRV)聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)检测方法,对其PCR反应条件进行了优化,并对25个猪场210份可疑猪伪狂犬病病毒感染的病料进行了检测。结果表明:25个猪场有24个检出PR阳性,猪场检出率为96%;猪伪狂犬病病毒总体感染阳性率达60.5%(127/210),感染阳性率最高为100%,最低为0。猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(PRV)引起的产品。猪的传染性繁殖障碍性疾病。近年来,有人用聚合酶1.2方法链反应(polymerasechainreaction,PCR)诊断技术对1.2.1引物的设计用DNASIS分析伪狂犬病病毒采集的猪伪狂犬病病料进行检测,结果表明该法具有gD基因保守区序列的同源性,用引物设计软件Prim-快速、敏感性高等特点。试验优化建立了猪伪狂犬病erPremier3.0设计引物,引物长度为18~25bp,扩病毒的PCR检测方法,并对临床可疑猪伪狂犬病病增片段长度为200~700bp。引物序列为PR15c-毒感染的病料进行了应用检测,现报道如下。cacggaggacgagctggggct-3c,PR25c-gtccacgccccgc-1材料与方法cgcttgaagct-3c,扩增片段长度理论值为217bp。引1.1材料物由北京赛百盛生物技术有限公司合成。1.1.1病毒、细菌和病料猪伪狂犬病病毒(Bartha1.2.2病毒DNA的抽提取伪狂犬病病毒细胞培k61)、猪细小病毒,由原中国人民解放军军需大学病养液100LL或疑似伪狂犬病病毒感染病料(肺脏)毒室惠赠;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆20mg于匀浆器中,加入500LL病料DNA抽提裂解菌、猪肺炎巴氏杆菌、沙门杆菌,由佛山科学技术学院缓冲液后充分研磨,倒入EP管,加1LL蛋白酶K预防兽医研究室提供。病料采自佛山、惠州、东莞、高(20mg/mL),56e水浴4h;98e水浴5min灭活蛋要、阳江、肇庆、四会、深圳、三水、新兴、鹤山等地。白酶K,冰浴5min;加入等体积酚-氯仿,旋涡振荡1.1.2其他试剂TE(pH值为8.0):10mmol/L1min使之充分混匀,静置10min后12000g离心Tris-Cl(pH值为8.0),1mmol/LEDTA(pH值为10min;取上清液,重复加酚-氯仿抽提;离心,取上8.0),50@TAE242g,冰醋酸57.1mL,0.5mol/L清液加入等体积异丙醇,旋涡混匀,静置10min后EDTA(pH值为8.0)100mL,加三蒸水至1000mL。12000g离心10min;弃上清液,加入75%乙醇病料DNA抽提裂解缓冲液:0.01mol/LTris-HCl1mL,7500g离心10min;弃酒精,真空干燥5min,(pH值为8.0),1mmol/LEDTA,100mmol/LNaC,l加入20LL双蒸水溶解所抽提DNA。0.5%SDS。BlendTaq酶,TOYOBO公司产品;dNTPs1.2.3PCR检测方法的初步建立反应体系:10@(2.5mmol/L)、DL-2000Marker、琼脂糖,宝生物工BlendTaq酶缓冲液2.5LL,dNTP(2.5mmol/L)程(大连)有限公司产品;PCR产物胶回收试剂盒,O-2LL,DNA模板2LL,引物(P1、P2等体积混合物,终mega公司产品;无水乙醇、氯仿等,均为国产分析纯浓度为0.5Lmol/L)1LL,ExTaq酶(5U/LL)0.25LL,ddH2O17.25LL,总体积25LL。收稿日期:2009-10-08;修回日期:2010-01-06PCR反应过程:94e预变性5min;94e变性基金项目:广东省自然科学基金项目(34060)30s,55e退火30s,72e延伸1min,共30个循环;作者简介:曾强(1970-),男,兽医师,硕士.最后72e延伸7min。 HeilongjiangAnimalScience120andVeterinaryMedicinel420101.2.4PCR反应合适条件的确定退火温度分别为53.2,55.5,58.1,60.8,6.02,63.2e,引物终浓度2+分别为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2Lmol/L,Mg浓度分别为1.5,2.0,2.5,3.0,3.5mmol/L,按1.2.3体系进行PCR扩增。1.2.5敏感性试验选择1.2.4得到的PCR合适1~5.模板稀释度分别为1@10-1,1@10-2,1@10-3,1@10-4,1@10-5;C.空白对照;M.DL-2000Marker。反应条件,取100LL猪伪狂犬病病毒细胞毒制备-1-5图3敏感性试验结果DNA模板,将DNA模板进行1@10~1@10稀释,按1.2.3测定的PCR合适条件进行敏感性检测。1.2.6特异性试验将PCR产物克隆测序或直接测序(由上海博亚生物技术公司和上海基康公司完成),测序结果与NCBIGenBank收录序列进行同源性比较。同时,按上述优化的PCR条件检测伪狂犬病病毒参考毒株模板,并设立猪细小病毒、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎巴氏杆菌M.DL-2000Marker;1.猪伪狂犬病病毒;2.猪细小病毒;和沙门杆菌等对照。3.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;4.副猪嗜血杆菌;5.猪肺炎巴氏杆菌;6.沙门杆菌;C.空白对照。1.2.7重复性试验按优化后的PCR合适反应条图4特异性试验结果件对采自感染猪伪狂犬病病毒猪场的5个病料样品进行重复检测,并设伪狂犬病病毒参考毒株阳性和阴表1猪伪狂犬病病毒参考株扩增区核苷酸序列性对照。与GenBank中注册序列的同源性比较1.2.8临床病料检测按上述试验优化PCR反应序列长度猪伪狂犬病病毒参体系对从25个猪场采集的210份病料进行检测。序列注册号/bp考株的同源性/%2结果AY1969842171002.1PCR反应合适条件的测定结果(见图1,2)AY174090217100AY169694217100AY21709421799AF08670221799M1400121799AF09244721799Y1483421798AJ271967217981~5.温度分别为53.2,55.5,58.1,AJ2719662179860.8,62.0e;C.空白对照;M.DL-2000Marker。图1退火温度的测定结果表25个病料样品进行猪伪狂犬病病毒的PCR重复检测结果样品编号第1次PCR检测第2次PCR检测1++2++3++4++5++1~6.引物浓度分别为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2Lmol/L;M.DL-2000Marker。3.1关于猪伪狂犬病病毒的PCR检测条件的优化图2引物浓度测定结果2+对于常规的PCR,Mg浓度一般在0.5~5mmol/L之间,dNTPs浓度一般要求为0.15~2.2敏感性试验结果(见图3)0.3Lmol/L,Taq酶用量一般为0.5~1.25U/LL。试2.3特异性试验结果(见图4、表1)验选用对其影响较大的退火温度、引物浓度进行优化。2.4重复性试验结果(见表2)退火温度:退火温度一般以-5e为起点,以2.5临床病料检测结果(见表3)2e梯度递增。在理想状态下,退火温度足够低,以3讨论 5黑龙江畜牧兽医6科技版2010年4月(上)121表3猪场可疑病料PCR检测结果猪场检测样品阳性样品阳性率猪场检测样品阳性样品阳性率猪场检测样品阳性样品阳性率序号数/份数/份/%序号数/份数/份/%序号数/份数/份/%13133.310201155.0197571.422150.0115240.020201470.03271970.4128787.5211218.346466.71310101002210990.0510660.0141000235360.06331001510330.0243266.7710880.0162150.0253266.781010100175120.0总计21012760.5922100187228.6保证引物同目的序列有效退火;同时还要足够高,以放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎巴氏杆菌、沙门杆菌减少引物与模板的非特异性结合。从图1可知,温度和阳性、阴性对照进行特异性检测。从图4可知,只在53.2~62.0e之间均能有效扩增,但在55.5e以有猪伪狂犬病病毒单项PCR能扩增出预期大小的下有非特异扩增条带,表明猪伪狂犬病病毒的PCRDNA片段,引物对猪伪狂犬病病毒毒株得到了阳性检测最适退火温度为58~62e。结果,而对照病毒、细菌均为阴性,未能扩增出任何非引物浓度:引物浓度一般为0.2~1.2Lmol/L,特异性DNA片段。同时,将PCR产物克隆测序结果在一定范围内,引物浓度越高,PCR产量越高,但引与NCBI公布序列进行同源性分析,结果表明同源性物浓度过高也容易造成非特异性扩增。从图2可知:为98%~100%(见表1),表明优化建立的PCR检测当引物浓度为0.2Lmol/L时不能有效扩增条带;当方法具有良好的特异性。引物浓度为0.4~1.2Lmol/L时均能有效扩增。表对采自感染猪伪狂犬病病毒猪场的5个病料样明猪伪狂犬病病毒的PCR检测最适引物浓度为品进行PCR重复检测,结果表明,第1次、第2次检0.4~1.2Lmol/L。测结果完全符合,5个样品猪伪狂犬病病毒都为阳3.2关于猪伪狂犬病病毒的PCR检测敏感性、特异性。表明试验所建立的PCR检测方法具有良好的重性和重复性复性。用于诊断的PCR要求针对目的病毒基因保守区3.3关于猪伪狂犬病病毒的PCR临床检测初步应设计引物。猪伪狂犬病病毒只有1个血清型,基因序用列较保守。目前,用于PCR诊断的猪伪狂犬病病毒运用优化建立的PCR诊断猪伪狂犬病病毒感染基因片段主要有gB、gD、gG以及gE等,其中gD基因敏感性高、特异性强且快速,极大地提高了对猪伪狂是病毒的主要中和抗原基因,并且参与病毒感染的吸犬病病毒的检出率,适用于临床诊断、进出口检疫。附和穿入过程。因此,试验选取gD基因作为伪狂犬有人用PCR方法分别对猪伪狂犬病病毒野毒株、鼻病PCR诊断的主要候选基因,并根据其基因序列保拭子样品进行检测,通过扩增gD基因序列检测出猪守区同源性片段特点设计猪伪狂犬病病毒的PCR伪狂犬病病毒。尽管PCR具有敏感性高、可进行活上、下游引物,长度为18~25bp,扩增200~700bp,体检测等优点,但其特异性受引物设计合理性的影扩增片段长度理论值为217bp,提高了PCR扩增敏响,引物设计不合理则会增加非特异性反应,甚至不感性和特异性。能扩增出特异性片段。值得探讨的是Wheeler等从衡量PCR敏感性的主要指标是已知含毒量的标阳性康复猪血清检出了病毒DNA,但却分离不到病准病毒液的检测最低稀释度。试验优化建立的PCR毒。提示在临床上运用PCR检测时,还应注意区分反应体系中,取100LL猪伪狂犬病病毒细胞毒制备疫苗免疫猪还是野毒感染猪。-1-5DNA模板,将DNA模板进行1@10~1@10稀运用优化建立的猪伪狂犬病病毒的PCR检测方释,按1.2.3的PCR反应过程进行试验。从图3可法检测了25个猪场共计210份伪狂犬病疑似病料,-5知,猪伪狂犬病病毒的PCR检测敏感度为1@10稀结果从24个猪场检出猪伪狂犬病病毒阳性,猪场检释DNA模板(100.2TCID50),表明试验所建立的PCR出率为96%;猪伪狂犬病病毒阳性率达60.5%(127/检测方法敏感性良好。210),猪伪狂犬病病毒感染阳性率最高为100%,最PCR特异性的主要指标是是否扩增非预期大小低为0,提示广东省部分地区猪伪狂犬病病毒感染较DNA片段。试验选择已确定的PCR最适反应条件,严重,不同地区存在明显差异。(009)用猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪传染性胸膜肺炎