资源描述：
《猪伪狂犬病病毒pcr检测方法的优化建立及初步应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、5黑龙江畜牧兽医6科技版2010年4月(上)119猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的优化建立及初步应用12111曾强,陈响坤,顾万军,黄良宗,白挨泉(1.佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山528231;2.佛山科学技术学院图书馆,广东佛山528231)+中图分类号:S852.659.1文献标识码:B文章编号:1004-7034(2010)04-0119-03关键词:猪伪狂犬病病毒;PCR检测方法;初步应用摘要:为了建立敏感性高、特异性高、重复性好的猪伪狂犬病病原的PCR检测方法,试验根据初步建立的猪伪狂
2、犬病病毒(PRV)聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)检测方法,对其PCR反应条件进行了优化,并对25个猪场210份可疑猪伪狂犬病病毒感染的病料进行了检测。结果表明:25个猪场有24个检出PR阳性,猪场检出率为96%;猪伪狂犬病病毒总体感染阳性率达60.5%(127/210),感染阳性率最高为100%,最低为0。猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(PRV)引起的产品。猪的传染性繁殖障碍性疾病。近年来,有人用聚合酶1.2方法链反应(polymerasechainreaction
3、,PCR)诊断技术对1.2.1引物的设计用DNASIS分析伪狂犬病病毒采集的猪伪狂犬病病料进行检测,结果表明该法具有gD基因保守区序列的同源性,用引物设计软件Prim-快速、敏感性高等特点。试验优化建立了猪伪狂犬病erPremier3.0设计引物,引物长度为18~25bp,扩病毒的PCR检测方法,并对临床可疑猪伪狂犬病病增片段长度为200~700bp。引物序列为PR15c-毒感染的病料进行了应用检测,现报道如下。cacggaggacgagctggggct-3c,PR25c-gtccacgccccgc-1
4、材料与方法cgcttgaagct-3c,扩增片段长度理论值为217bp。引1.1材料物由北京赛百盛生物技术有限公司合成。1.1.1病毒、细菌和病料猪伪狂犬病病毒(Bartha1.2.2病毒DNA的抽提取伪狂犬病病毒细胞培k61)、猪细小病毒,由原中国人民解放军军需大学病养液100LL或疑似伪狂犬病病毒感染病料(肺脏)毒室惠赠;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆20mg于匀浆器中,加入500LL病料DNA抽提裂解菌、猪肺炎巴氏杆菌、沙门杆菌,由佛山科学技术学院缓冲液后充分研磨,倒入EP管,加1LL蛋白酶
5、K预防兽医研究室提供。病料采自佛山、惠州、东莞、高(20mg/mL),56e水浴4h;98e水浴5min灭活蛋要、阳江、肇庆、四会、深圳、三水、新兴、鹤山等地。白酶K,冰浴5min;加入等体积酚-氯仿,旋涡振荡1.1.2其他试剂TE(pH值为8.0):10mmol/L1min使之充分混匀,静置10min后12000g离心Tris-Cl(pH值为8.0),1mmol/LEDTA(pH值为10min;取上清液,重复加酚-氯仿抽提;离心,取上8.0),50@TAE242g,冰醋酸57.1mL,0.5mol/L
6、清液加入等体积异丙醇,旋涡混匀,静置10min后EDTA(pH值为8.0)100mL,加三蒸水至1000mL。12000g离心10min;弃上清液,加入75%乙醇病料DNA抽提裂解缓冲液:0.01mol/LTris-HCl1mL,7500g离心10min;弃酒精,真空干燥5min,(pH值为8.0),1mmol/LEDTA,100mmol/LNaC,l加入20LL双蒸水溶解所抽提DNA。0.5%SDS。BlendTaq酶,TOYOBO公司产品;dNTPs1.2.3PCR检测方法的初步建立反应体系:10@
7、(2.5mmol/L)、DL-2000Marker、琼脂糖,宝生物工BlendTaq酶缓冲液2.5LL,dNTP(2.5mmol/L)程(大连)有限公司产品;PCR产物胶回收试剂盒,O-2LL,DNA模板2LL,引物(P1、P2等体积混合物,终mega公司产品;无水乙醇、氯仿等,均为国产分析纯浓度为0.5Lmol/L)1LL,ExTaq酶(5U/LL)0.25LL,ddH2O17.25LL,总体积25LL。收稿日期:2009-10-08;修回日期:2010-01-06PCR反应过程:94e预变性5min
8、;94e变性基金项目:广东省自然科学基金项目(34060)30s,55e退火30s,72e延伸1min,共30个循环;作者简介:曾强(1970-),男,兽医师,硕士.最后72e延伸7min。HeilongjiangAnimalScience120andVeterinaryMedicinel420101.2.4PCR反应合适条件的确定退火温度分别为53.2,55.5,58.1,60.8,6.02,63.2e,引物终浓度2+分别为0.2,0.4
