猪腺病毒3型PCR检测方法的建立及Hexon基因克隆分析.docx

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1、猪腺病毒3型PCR检测方法的建立及Hexon基因克隆分析猪腺病毒3型(Porcineadenovirus3,PADV-3)是猪腺病毒中最常见的一种血清型,主要引起猪群腹泻。1964年Haig首次从英格兰腹泻仔猪直肠拭子中分离到该病毒,随后在澳大利亚、美国、加拿大、西班牙、中国等国家相继被报道。目前,由于对PADV-3研究较少,在该病毒结构和功能、诊断方法、流行病学、致病性等方面均有待深入系统研究。本研究根据GeenBank中登陆的PADV-3E1B基因序列(登录号：AB026117),利用Primer5.0软件设计两对特异性引物,预计扩增片段大小分别为247bp和194bp。经条件优化,成

2、功建立了针对PADV-3PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法,两种方法的特异性和重复性较好,且均具有较高灵敏度,分别最低可检3.7×10~5拷贝/μL和3.1×10~2拷贝/μL。应用本研究建立的常规PCR开展PADV-3感染情况调查,对从四川省部分地区收集的283份粪便样品进行检测。结果显示,PADV-3总阳性率为7.07%(20/283),非腹泻猪群PADV-3阳性率为3.31%,腹泻猪群中PADV-3阳性率为9.87%,显著高于非腹泻猪群。应用所建实时荧光定量PCR开展PADV-3感染组织特性研究,对8头PADV-3感染阳性仔猪相应组织器官进行采样检测。结果显示,肠粘膜、肠系膜淋巴

3、结、肺、扁桃体中PADV-3含量分别为2.24×10~4～6.42×10~5拷贝/mg、9.49×10~3-7.36×10~4拷贝/mg、5.59×10~3～1.65×10~5拷贝/mg和9.93×10~3～1.89×10~5拷贝/mg,病毒含量显著高于其它组织器官。根据GenBank中PADV-3Hexon基因序列(登录号：AC000189)设计两对引物。以阳性病料DNA为模板,分段扩增克隆,经测序分析,得到Hexon全基因序列(登录号：KU761583)。利用生物信息学软件对所获PADV-3Hexon全基因进行分析。结果显示,所获Hexon全基因为2799bp,编码932个氨基酸,理论

4、分子质量为10~5653.8u,理论等电点为5.23；该蛋白不稳定指数为42.92,属不稳定蛋白；且同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性。该蛋白最大疏水指数和最小疏水指数分别为2.289和-3.011,表现一定疏水性；氨基酸中无信号肽切割位点,推测该蛋白缺乏信号肽。Hexon蛋白含有25个丝氨酸、18个苏氨酸、21个络氨酸激酶磷酸化位点和35个抗原位点。将PADV-3克隆株(SCMS01株)与参考株的Hexon基因核昔酸序列进行同源性分析。结果显示,核苷酸同源性为87.8%-10~0%,表明PADV-3在各国之间流行不稳定。对SCMSOl株和参考株Hexon基因构建系统进化树。结

5、果显示,SCMSOl株与德国株(PGOU244)在一个小分支上,两者亲缘性较高。