金黄色葡萄球菌eap基因克隆表达及双重pcr检测方法建立

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1、分类号ICS学校代码学号10136菱=萋～菱一§蒙古民燕大学硕士学、．又金黄色葡萄球菌eap基因克隆表达及双重PCR检测方法建立TheCloningandExpressionofStaphylococcusAureusEapGeneandtheEstablishmentofDoublePCRDetectionMethod申请人：马万欣学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病的分子流行病学和防制新方法研究学位类别：学术学位指导教师：高原教授提交日期：二O一二年五月摘要目的：1．构建鹅源金黄色葡萄球菌eap靶基因原

2、核表达载体，并初步研究目的蛋白的免疫学活性及其应用。2．金黄色葡萄球菌eap靶基因双重PCR检测方法的建立。方法：1．依据Genebank中公布的eap基因全长信息，PCR扩增内蒙古鹅源分离株的eap基因片段，将纯化回收后的目的片段克隆到pMDl8一TVector载体上，经实验室PCR扩增和单双酶切鉴定，鉴定正确后测序分析。测序分析『F确后构建pET28a—eap重组质粒并转化到大肠杆菌E．coliBL21中。经IPTG诱导SDS—PAGE鉴定成功后，用Ni—NTA亲和柱获取的纯化的Eap蛋白和全菌体灭活菌苗分

3、别免疫家兔，应用Western—blot方法检测重组Eap蛋白的免疫活性。建立间接ELISA方法，研究目的蛋白的反应原性。2．以金黄色葡萄球菌的eap基因为靶基因设计引物，通过PCR扩增技术检测100株由临床采集并分离的细菌。首先对临床采集的100株标本进行分离纯化并根据生物学特性进行大致区分。通过国际公认的葡萄球菌特异性基因16srRNA与金黄色葡萄球菌特异性eap基因序列双重分析法鉴定，其中有57株为目的菌。结果：1．成功构建pET28a—eap／BL21，在pET28a(+)系统中成功表达了Eap融合蛋白

4、，获得小量纯化的Eap重组目的蛋白。2．成功应用葡萄球菌特异性基因16srRNA和金黄色葡萄球菌特异性eap基因为检测靶点，建立一种能快速灵敏的检测病原菌的双重PCR检测方法。结论：1．在pET28a系统中成功表达了Eap融合蛋白并小量纯化，为进一步研究其生物学活性及临床诊断治疗奠定相关的理论基础。2．应用eap基因作为一种具体的诊断工具用于标识目的致病菌。为从分子水平上快速鉴定病原菌提供了简单、快速、准确的方法。关键词：金黄色葡萄球菌；禽葡萄球菌病；原核表达；间接ELISA；多重PCRTheCloningan

5、dExpressionofStaphylococcusAureusEapGeneandtheEstablishmentofDoublePCRDetectionMethodPurposes：Abstract1．ToconstructProkaryoticExpressionVectorforcaptargetgenesofStaphylococcusaureusingeesesource，andpreliminarystudyontheimmunologicalactivityoftargetproteinsan

6、dit’Sapplication．2．ToestablishdoublePCRtechnologyfortestingtargetgeneofcap．Methods：1．AccordingtocapfulllengthgeneinformationontheGenebank，amplifycapgenefragmentfromInnerMongolianGoose—derivedisolatesbyPCR，andclonedthepurposeclipstopMD18一TVectorafterpurificat

7、ionandrecovery，anditwillbesendtodosequencinganalysisafteridentifiedtobecorrectbyLaboratoryPCRamplificationandSingleordoubleenzyme．IftheresultofSequencinganalysisiscorrect．pET28a—caprecombinantvectorwillbeconstructedandtransferredintoE．coliBL21．Afterthesucces

8、sfulidentificationofSDS-PAGEappraisalinducedbyIPTG，domesticrabbitwillberespectivelydonetobeimmunetopurifiedEapproteingaindbyNi—NTAaffinitycolumnandthevaccinewhichareallinactivated，andthenusetheW