金黄色葡萄球菌CHIPS基因克隆及原核表达

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1、摘要金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白(chemotaxjs1nhibitoryProtejnof＆印垣Pf。∞cc砒口骈埘，cHIPs)是由金黄色葡萄球菌分泌到菌体外的一种蛋白，能特异性地与中性粒细胞和单核细胞上的c5a受体(c5aR)和fMLP受体(FPR)结合，从而阻止细胞的趋化作用。但是，可否将CHlPs作为药物来治疗由c5a或日订LP诱发的炎症性疾病或将cHIPs作为免疫原来防制金黄色葡萄球菌感染，目前尚不清楚。本试验设计合成了一对PCR扩增特异性引物，分别从金黄色葡萄球Newman株和cowallI株中扩增获得了cHIPs基因，进一步将其克隆到pMDl8-T载体获得

2、重组质粒pMD-N和pMD-c。并对其进行测序分析。结果，与GenB“k中提供的cHlPs基因序列相比，Newman株具有100％的同源性，cowan】株只有一个碱基突变R298A—G：二者氨基酸同源性均为100％。说明cHIPs基因高度保守。将pMD-N，pMD-c质粒和pEl’32a(+)表达载体进行勘mH】和曲¨双酶切，回收cHlPs基因片段，将其插入到pET32a(+)原核表达载体并转化到B02l(DE3)EcDff，经筛选分别获得pET-N仍E3和pET-c舰3重组体细菌。经1P1B诱导表达和sDs．PAGE分析，结果与对照菌株相比，诱导后的pE]：N仍E3和

3、pET-c／DE3表达约为31．8kDa的融合蛋白，且表达蛋白存在于菌体超声波裂解上清中；进一步对其进行westem_blotting分析证实，表达的融合蛋白为目的蛋白。说明本试验cHIPs得到了良好表达，且为可溶性蛋白。用MagneHisT”蛋白纯化系统对表达的CHPs蛋白进行纯化，并将纯化后的cHIPs蛋白用于人工刨伤感染韵动物模型试验，结果与对照组相比，使用cHDs蛋白组对创伤感染愈合具有明显的延迟作用，表明cHIPs蛋白对炎症具有抑制或延缓作用。关键诃：趋化抑制蛋白，基因克隆，原核表达，c5a受体。fMLP受体Abstractchemotaxisinhjbito

4、ryprotejnof所珈，∞Dcc淞口“M珊(cHIPs)isakindofproteinthatexcretedbyS口ⅣrP淞．CHlPscanspec雨callybindtoc5areceptor(C5aR)a11dtheforInylatedpeptidereceptor(FPR)existingonthesurfaceofneutrophils枷dmonoc”es，therebyb】ockchemotaxjsofneutrophjlsandmonocytesmediatedbyC5aandfonnylatedpeptides，respectiVely．But

5、，itis1essknownuptonowthatwhemerCHIPScallbeusedaSacandidatedmgfor廿10seinn啪matorydiseasesinducedbyC5aandforInylatedpeptidesaIld／0rana11tigenforpmV0kingimmuneresponseagainst&口we螂infectjon．1nthjs『epon，thegenesofcHIPs如m＆dm℃淞Newmanandcow柚lstrainswere锄plifiedbyPCRwithapairofprimerSandsuccessfIl

6、llyintroducedrespectjVelyjntopMDl8-Tvectors．1’worecombinalltclones，pMD-NandpMD-C，can了ingtlleCHIPSgeneofNe砌aIla11dCowallIstrainwereob诅inedandsequenced．ThenucleotidesequenceOf也eCHlPSgene‰NewmanstrainhadlOO％hom0109ytomesequencepublishedpreviouslyinGenB卸k锄dthat疗DmCowan1strainhadonlyonemu协tio

7、n(R299A_÷G)comparedw曲廿lesequencepublislledpreviouslyinGenBank．Thededuced啪inoacidsequencesofllleCHIPSf而mNewmaIla11dCowaIl1s打ajnwere100％homologytothesequencepublishedpreviously．ThoSesu鹊estedthatt11eCHIPSgenewashigh】yconserva石Ve．Thep∞_N，pMDcp1踟idandthepET32a(+)ex孵sionVec瞬weT