实时荧光定量pcr检测金黄色葡萄球菌fema表达

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1、实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达【摘要】目的探讨实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达的方法。方法以BB270femA基因表达为标准，建立实时荧光定量PCR方法，对实验菌株femA表达进行相对定量。结果建立的实时荧光定量PCR方法所得结果标准曲线线性关系好，熔解峰单一。随MIC变化，金黄色葡萄球菌femA表达水平也随之变化。结论用实时荧光定量PCR方法研究金黄色葡萄球菌femA表达量结果可靠、敏感、重复性好。【关键词】金黄色葡萄球菌；femA基因；实时荧光定量PCRAbstr

2、act：ObjectiveToestablishtheapproachofreal-timefluorescentquantitativePCRtodetectfemAgeneinStaphylococcusaureusstrains.MethodsReal-timefluorescentquantitativePCRedtoquantifytheexpressionoffemAgeneof15clinicalstains,asparedefluorescentquantitativePCRshoou

3、ntoffemARNAandcyclethresholdandthemeltingcurvehadasinglepeak.ThevariationofexpressionleveloffemAefluorescentquantitativePCRinthedetectionoffemAexpressionisaccurate,sensitiveandrepeatable.KeyAgene;real-timefluorescentquantitativePCR实时荧光定量PCR（real-timeflu

4、orescencequantitativePCR，real-timeQ-PCR）由于其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点，目前已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域中，其中最主要的应用集中在以下几个方面：DNA或RNA的绝对/相对定量分析，基因表达差异分析，基因分型。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA）是全球感染性疾病领域研究热点之一。已知femA是MRSA耐药表达的重

5、要辅助基因，与MRSA高水平耐药成正相关［1-3］，但还未见研究报道两者确切关系。本实验利用近年来兴起的实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA基因表达水平，进一步明确femA在MRSA耐药表达中的意义。同时建立实时荧光定量PCR用于金黄色葡萄球菌RNA定量检测的具体方法和稳定体系。1材料和方法1.1菌株和生长条件我院微生物室从临床送检标本中分离鉴定所得金黄色葡萄球菌，选取MSSA4株，低耐MRSA4株，高耐MRSA7株。1株瑞士捐赠株：BB270［1］。上述金黄色葡萄球菌在M-H培养基复苏16h

6、，挑取菌落置于M-H肉汤中在37℃震荡培养，测量D600nm，10倍稀释10个浓度，取50μl菌液过夜孵育，选取菌落数在100～300之间的稀释倍数计算活菌数。1.2最低抑菌浓度（MIC）测定以琼脂平皿对倍稀释法测定苯唑西林对16株菌的MIC值，以ATCC25923为质控株，结果判定参照CLSI2006常规标准。1.3RNA提取、纯化、逆转录采用RNA提取纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司），操作按说明书进行。提取前菌液中加入溶葡萄球菌素（16U/ml，上海生工生物工程有限公司）。测D260nm以及

7、D260/D280，取D260/D280比值>1.8者继续下一步试验。采用RT-PCR试剂盒（TaKaRa生物工程大连有限公司），操作按照说明书进行。反转录反应：42℃，15min，95℃，2min。1.4realtimeQ-PCR引物及方案内参平均与之相比。金黄色葡萄球菌MIC与femA表达水平关系见表2。可以看出femA表达水平随MIC水平的变化而变化。表216株金黄色葡萄球菌femA表达水平3讨论实时荧光定量PCR是近年来定量核酸较为准确的方法，可根据样品的循环阈值参照标准曲线，经计算机处

8、理后可准确计算出标本内核酸的起始浓度。SYBRGreenⅠ是一种只与双链DNA结合的染料，当它与双链DNA结合时，发出荧光，随着PCR产物的增加，产物与SYBRGreenⅠ结合的量也增大，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，整个过程要求高质量的RNA、内参和目的基因引物特异性、PCR扩增效率一致、重复试验平衡差异等来保证结果的可靠性。本实验基于SYBRGreenⅠ的实时荧光定量PCR方法用于本实验所得结果标准