基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤

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1、基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤1材料（试剂和耗材）1.1样本（小鼠组织）-2个1.2引物（lifetechnology公司合成）1.3BestarTMqPCRRTKit（德国DBI货号：DBI-2220）1.4Bestar®SybrGreenqPCRmastermix（德国DBI货号：DBI-2043）1.596孔板（美国lifetechnology）2材料（仪器）2.1ABI7500荧光定量PCR仪（lifetechnology公司）2.2TGL-16M低温冷冻离心机（湘仪）2.3SW-CJ-1D单人净化工作台

2、（泸净净化）2.4HR40-ⅡA2生物安全柜（Haier）3实验步骤3.1RNA的抽提RNA的提取按lifetechnology公司提供的TriozolRNA提取试剂盒的使用说明进行。程序如下：（1）将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mlTRIzol；（2）加入0.2mL氯仿，盖紧离心管管盖，上下颠倒混匀60s（请勿涡漩激烈振荡），室温静置3min，12,000g，4℃离心15min，置于冰上；（3）溶液分为三层，RNA溶解在水相中，小心吸取500μl水相至另一个新的RNasefree的EP管中；（4）加

3、入500μl异丙醇，-20度放置1h，12,000g，4℃离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃上清；6（5）加入1ml75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清；（6）超净工作台上吹干样品10min，加入适量DEPC水溶解RNA。加入40μlDEPC水溶解沉淀。3.2RNA质量检测紫外分光光度计测定RNA浓度：sampleIDconcentration(ng/μL)260/280a9981.87b10241.973.3去基因组DNA和cDNA的合成将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000

4、g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。把RNA在65°C条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。逆转录反应：5×RTBuffer2μLRTEnzymeMix0.5μLPrimerMix0.5μLRNA6μLRNase-freeWater1μLToal10μL反应条件：37°C,15min98°C,5min4°C,hold反应结束后，-20°C保存。63.4cDNA的实时荧光定量PCR3.4.1实验步骤每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20μL，根据表1.配置。反应条件

5、为：95°C2min95°C10s45个循环60°C34s（采集荧光信号）72°C30s循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。表120μl荧光定量PCR反应体系试剂体积（μL）终浓度灭菌蒸馏水4.46/　Bestar®SybrGreenqPCRmastermix101×ForwardPrimer(20μM)0.250.25μMReversePrimer(20μM)0.250.25μM50×ROX0.040.1×模板5/　Total20/　表2使用的引物基因名称GenebankID引物序列扩增长度（bp）Mus-G

6、APDHNM_001289726.1Forward：TCCACTCACGGCAAATTCAAC146Reverse：GTAGACTCCACGACATACTCAGCxNM_*****Forward：Reverse：yNM_*****Forward：Reverse：3.4.2实验结果的分析方法本实验采用2-△△Ct法进行分析，计算公式为：F为相对表达量，根据此次试验的设计，对照组中的目的基因表达量为1。64结果4.1扩增曲线GAPDH基因扩增曲线x基因扩增曲线y基因扩增曲线64.2熔解曲线GAPDH基因熔解曲线x基因熔解曲

7、线y基因熔解曲线-24.3实验数据见EXCEL表格。备注：DCt=目的基因Ct-管家基因Ct；DDCt=待测样品DCt-对照样品DCt；2-DDCt=相对表达量。4.4柱形图6广州辉骏生物科技有限公司6