实时荧光定量PCR

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1、CodeNo.RR716研究用SYBR®PrimeScript™miRNART-PCRKit说明书v201211Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存2●试剂盒原理2●特长3●RNA样品制备3●操作注意4●操作方法51．Poly(A)加尾反应和反转录反应52．RealTimePCR反应5◆应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem扩增仪的操作方法5◆应用ABIPRISM7000/7700/7900HT，67300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem的操作方法◆应用LightCyclerRe

2、alTimePCR扩增仪的操作方法8●实验条件的选择9●实验例9●引物设计说明10●Q&A11●制品说明本制品中含有合成Poly(A)多聚尾和合成cDNA所需的全部试剂，可以将样品中的miRNA（起始样品可以是TotalRNA、smallRNAfragments等任何包含miRNA的样品）经过一次反应合成为1stStrandcDNA（样品中的mRNA、snoRNA等其它形式的RNA也会同时被反转录成cDNA）。本试剂盒经过特别的优化，将Poly(A)加尾反应和cDNA合成反应同步进行，在1小时内即可完成miRNA1stStrandcDNA合成，且产

3、物无需进行纯化，可直接使用PCR反应试剂SYBRPremixExTaqII进行RealTimePCR定量检测，从而准确简便地对miRNA（或mRNA、snoRNA等其它RNA分子）进行表达量分析。由于本试剂盒对反应样品进行的Poly(A)加尾以及cDNA合成不具有特异性，所以经过一次反转录得到的产物可以用于多种miRNA以及mRNA、snoRNA等的定量分析。本制品可以从10pg~5μgTotalRNA反转录合成miRNAs、mRNAs和snoRNA等的1stStrandcDNA，再通过RealTimePCR反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标

4、准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。●制品内容（50μl反应×200次）本制品由[A.反转录反应试剂]和[B.PCR反应试剂]两部分构成。A.反转录反应试剂1.2×miRNAReactionBufferMix（forRealTime）*1200μl2.miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix40μl3.0.1%BSA40μl4.Uni-miRqPCRPrimer（10μM）200μl5.RNasefreedH2O1ml×26.EasyDilution（forRealTimePCR）*21ml*1含有dNTPMixt

5、ure、Mg2+和反转录用的UniversalAdaptorPrimer。*2制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或模板RNA如果用水或TE稀释时，由于受Microtube的吸附作用等原因的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。EASYDilution也可以单独购买（CodeNo.9160）。EASYDilution请与本公司RealTimePCR试剂组合使用，对于其他公司同类制品的适用性本公司尚未进行确认。B.PCR

6、反应试剂SYBRPremixExTaqII（PerfectRealTime）（2×Conc.）*31.0ml×5支ROXReferenceDye（50×Conc.）*4200μl×1支ROXReferenceDyeII（50×Conc.）*4200μl×1支*3内含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，SYBRGreenI等。*4只使用在LifeTechnologies、Agilent等公司的RealTimePCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。ABIPRISM7000/7700/7900HT和7300Rea

7、l-TimePCRSystem使用ROXReferenceDye，7500Real-TimePCRSystem和7500FastReal-TimePCRSystem使用ROXReferenceDyeII。ThermalCyclerDiceRealTimeSystem、LightCycler等RealTimePCR扩增仪时不必使用。-1-●保存[A.反转录反应试剂]请于-20℃保存。[B.PCR反应试剂]4℃保存6个月性能稳定。请避光保存，避免污染。若长期保存，请存放于-80℃，勿存放于-20℃。产品融解后请于4℃保存，并在6个月内用完。●试剂盒原理

8、1.反转录反应试剂盒中的miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix中包含Poly(A)Polymerase和反