金黄色葡萄球菌LukF和LukS基因的克隆和表达

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1、摘要金黄色葡萄球菌是一种重要的致病菌，可以引起人和动物盼多种疾病，其主要致病物质是毒素和酶，其中杀白细胞素可使白细胞失去吞噬功能，破坏中性粒细胞和巨噬细胞。杀自细胞素是双组分毒素，含F和s两种成分，二者协同作用于白细胞膜上形成孔状结构，溶解白细胞。本课题采用PcR的方法扩增出金黄色葡萄球菌杀白细胞素F(1ukF)基因和s(1uks)基因，分别与pMDl8-T载体连接，并转化到BL一21(DE3)大肠杆菌。经PcR和肋mHl、肋n双酶切鉴定后，获得的阳性克隆质粒命名为pMD-lukF和pMD一1uks。实验进一步将两个

2、阳性克隆和pET32a(+)表达载体用＆MHI协n双酶切，回收目的片段，并连接转化到BL．21(DE3)大肠杆菌，构建出表达质粒pET．1ukF和pET．1uks。测序结果与GeneBalll(中公布的序列相比，lukF和Iuks同源性均在99％以上，编码的氨基酸序列的同源性均为100％。重组菌pET-lukF，DE3和pET-luks舰3经IPTG诱导后进行sDs—PAGE，并用抗Histidine单抗进行westemBlot分析，结果pET．1ul(F，DE3表达出分子量约53kDa的蛋白质，pET-lul(F，

3、DE3表达出分子量约54kDa的蛋白质，二者分子量大小和Dnast”分析结果也相符，表明目的蛋白成功获得表达。在此基础上，用Ma鲫eHjsT”蛋白纯化系统对表达的1ukF和luks蛋白进行了纯化，为下一步研究金黄色葡萄球菌杀白细胞素的作用机理和免疫保护作用做了前期准备工作。关键词：金黄色葡萄球菌，杀白细胞素，F组分，s组分，克隆，表达，westemb10tJ】l独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰

4、写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名．互前时间年6其f芦关于论文使用授权的说明本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研

5、究生签名：二，阜，酮：№{年6只{7B鄂獬：红7．豸、帆J力纷多月，7日黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章前言金黄色葡萄球菌(＆印^yfo∞ccm口mw)是一种最为常见的革兰氏阳性致病菌，广泛分布于自然界，如空气、土壤、水及物品上，也经常存在于人和动物的皮肤以及外界相通的腔道中。金黄色葡萄球菌致病性很强，所导致的疾病种类也非常多，从普通的皮肤感染到细菌性心内膜炎以及毒素休克综合症等，危害极大。但总的说来，所引起的疾病可分为两类疾病，一类是毒素性疾病，被金黄色葡萄球菌污染的食物或饲料引起人或动物的中毒性呕吐、肠炎及人

6、的毒素休克综合症等；另一类是是化脓性疾病，例如动物的创伤感染、化脓性骨髓炎以及奶牛的急性、慢性或坏疽性乳房炎等。金黄色葡萄球菌是引起化脓性疾病的重要致病菌，并且是毒力最强的化脓菌。金黄色葡萄球菌主要依靠产生多种毒素和酶致病，如肠毒素、溶血素、致热性外毒素、中毒性休克综合症毒素l、剥脱素、杀白细胞素，血浆凝固酶、葡萄球菌溶纤维蛋白酶、耐热核酸酶、透明质酸酶等。此外，某些细胞壁结构也具有毒力因子的作用，如葡萄球菌蛋白A、荚膜、纤连素结合蛋白等。在这些致病因子中，研究较多的主要的还是毒素⋯。1．1金黄色葡萄球菌的主要毒素1

7、．1．1肠毒素(sta曲ylococcalenterotoX协，SE)sE是金黄色葡萄球菌产生的一种毒性蛋白质，已报道有A、B、c、D、E、F、o、H、I等血清型口捌。一般来说，具有毒力的金黄色葡萄球菌在适宜的条件下，大多数可产生各种不同类别的肠毒素。所有sE的氨基酸组成已经测定，分子中赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和酪氨酸等较集中，除sEF外，所有sE均含有由2个半胱氨酸残基形成的大约有20个氮基酸的胱氨酸环，sEA、sEB和sEcl分子羧基端有明显的相似性”I。各型sE均易溶于水和盐溶液，较能抵抗蛋白酶，并且非

8、常耐热，即使煮沸30分钟也不失活，必须在2】8℃～248℃经30分钟才能使其毒性完全消失。由于sE有抗蛋白酶分解作用，才使它在胃内环境中不被立即灭活，有时间通过胃粘膜发挥其毒性效应，误食金黄色葡萄球菌污染的食品可引起呕吐和腹泻等症状14J。并且，sE对T细胞具很强的有丝分裂原作用，可非特异性地激活多克隆T细胞，无需预先致敏，且无种属特异性。sE