奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌凝聚因子a+a区基因的克隆表达

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1、摘要乳腺炎是奶牛的一种常见病和多发病，其发生的主要原因是病原微生物感染。引起乳腺炎的病原微生物多达80多种，主要包括细菌、霉形体、真菌及病毒。细菌性病原微生物中，金黄色葡萄球菌占主要地位，但多年来对金黄色葡萄球菌性乳腺炎的防治一直没有有效的措施，本文拟对金黄色葡萄球菌凝聚因子AA区基因进行克隆表达，为研制预防金黄色葡萄球菌性乳腺炎生物工程疫苗提供基础。本试验根据GeneBank公开发表的NewMan株ClfAA区序列设计引物，利用PCR方法对呼和浩特周边地区存在的4个主要的金黄色葡萄球菌基因型进行扩增，获得了金黄色葡萄球菌的凝聚因子A(ClfA)A区基因。实验对四株不同基因型的

2、金黄色葡萄球菌的凝聚因子h(elfA)A区基因进行克隆测序，与Genbank登陆的标准NewMan株ClfAA区序列进行比对，基因3型、基因9型、基因11型与NewMan株同源性较高，分别为97．8％、96．5％、98．3％，基因5型与Newman株同源性仅为85．4％。同时基因3型、基因9型、基因1l型之间同源性也较高，而基因5型与另外三个基因型同源性也较低。将测定的序列用DNAstar软件进行抗原表位分析，基因3型、基因9型比NewMan株多一个抗原位点，因此选择了其中一个基因型即基因9型进行表达。将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中，获得了重组表达质粒pE

3、T-ClfA—Aregion。将其转化宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，表达了C1fA—A区蛋白。经定位分析，目的蛋白以可溶形式存在。His·bind柱子纯化后获得纯度较高的C1fA—Aregion蛋白。纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔，经三次免疫后得到了较高效价的抗血清。通过ELISA、试管凝集试验、抗体抗粘附能力检测、吞噬调理试验证明目的蛋白具有黏附活性，自制高免血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用。实验证实所表达的蛋白为ClfA-Aregion蛋白。关键词：奶牛乳腺炎；金黄色葡萄球菌：凝聚因子A(C1fA)；克隆；表达Cloning

4、andExpressionoftheregionAgeneofclumpingfactorAofStaphylococcusaureusfromBovineMastitisAbstractMastitisisaconunonandfi,equently-occurringdiseaseinthebovine，itiscausedbypathogenicmicroorganisms．Therearemorethaneightypathogenicmicroorganismswhichcancausemastitisinnature，suchasbacterium，mycoplas

5、ma,fungiandviruses．Staphylococcusaureusisthemainpathogeninthebacterium，andtherearenoeffectivemeasurestopreventmastitiscausedbyStaphylococcusaureus．SotheClumpingfactorAregiongenewereclonedandexpressedinthisarticletoprovidemateriasforproduceingvaccinesofmastitiscausedbyStaphylococcusaureus．Acc

6、ordingtotheClfAAsequencepublishedinGeneBankofNewManstrain，primersweredesigned，thenfourmajorgenotypesofStaphylococcusaureusfromHohhotwereamplified．FourClumpingfactorA(ellA)AregiongenesofStaphylococcusaureusweresequencedandcomparedwiththesequenceofstandardNewManinGenbank，theresultsshowedthat：h

7、omologyofgene-3，gene·9，gene-11、)l，ithNewmanstrainwererelativelyhigherthangene-5withNewman,itwere97．8％，96．5％，98．3％and85．4％respectively．Meanwhile，Homologyamonggene-3，gene-9werehigher,andloweringene5wimtheformerthreegenotypes．TheepitopewereanalyzedbyD