奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖主要血清型的鉴定及cap8J基因的克隆表达.pdf

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1、分类号S852.3学校代码10129UDC11.220学号08201082奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖主要血清型的鉴定及cap8J基因的克隆表达IdentificationofMainSerotypeCapsularPolysaccharidesandCloningExpressingofthecap8JGeneofStaphylococcusaureusIsolatedfromBovineMastitis申请人：郭宇学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物学与免疫学指导教师：郝永清教授论文提交日

2、期：二〇一一年六月摘要奶牛乳房炎是影响国内外奶牛养殖业的主要疾病之一，金黄色葡萄球菌（S.aureus）是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。94%~100%的S.aureus含有荚膜多糖，荚膜多糖是S.aureus菌体最外层保护性结构成份，与S.aureus抗多形核白细胞的吞噬作用有关。由于受到药物残留，细菌耐药性等因素制约，疫苗被认为是目前防治奶牛乳房炎最有效的手段和措施。为了解内蒙古地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖的主要血清型，本实验从内蒙古地区采集236份患奶牛乳房炎的病牛奶样，采用常规微生物方法、生物化学反应

3、方法、动物实验对引起奶牛乳房炎的S.aureus进行了分离鉴定，并采用PCR方法和玻片凝集试验对分离鉴定得到的S.aureus荚膜多糖的血清型进行了鉴定。结果分离得到162株葡萄球菌，其中金黄色葡萄球菌124株、表皮葡萄球菌29株和腐生葡萄球菌9株；动物实验结果得到116株致病性S.aureus；PCR方法和玻片凝集试验结果鉴定出荚膜多糖8型(CP8)的S.aureus61株，占致病性S.aureus的52.59%，PCR方法结果鉴定出荚膜多糖5型(CP5)的S.aureus23株，占致病性S.aureus的19.

4、83%，荚膜多糖5型和8型的S.aureus占致病性S.aureus的72.42%。本研究表明5型和8型是内蒙古地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖的主要血清型。在金黄色葡萄球菌荚膜多糖的主要血清型鉴定的基础上，本实验对分离自内蒙古地区的金黄色葡萄球菌荚膜多糖主要血清8型的cap8J基因进行了克隆和核苷酸序列分析，结果表明所扩增序列与GenBank中已有序列同源性达98%，并利用pET32a表达载体成功表达了cap8J基因，SDS-PAGE电泳检测结果表明，重组菌株表达出了17KD左右的目的蛋白，该融合蛋白为可溶性

5、蛋白，30℃，5h是蛋白采用IPTG诱导的最佳表达条件。利用CP8单克隆抗体对融合蛋白的抗原性进行检测，玻片凝集试验结果显示，融合蛋白与CP8单克隆抗体发生特异性凝集反应，表明该融合蛋白具有抗原性。本研究将为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖基因工程疫苗的研制奠定基础。关键词：奶牛乳房炎；金黄色葡萄球菌；荚膜多糖；cap8J；克隆表达IdentificationofMainSerotypeCapsularPolysaccharidesandCloningExpressingofthecap8JGeneofStaphy

6、lococcusaureusIsolatedfromBovineMastitisAbstractMastitisisoneofthelargestproductionconcernsinthedairyindustryworldwide.Staphylococcusaureus(S.aureus)isthemostcommonetiologicagentofmastitisinbovinesandamajorcauseofeconomiclossesinthedairyindustry.94%-100%S.aure

7、uscontaincapsulepolysaccharidewhichistheprotectivestructiveingredientsofthebacteria.Thecapsuleimpedesphagocytosisofthepolymorphonuclearneutrophil.TheeffectsofantibiotictherapyhasbecomingmoreandmoreworsebecauseS.aureushasthecapacityofadherenceandanchoragetomamm

8、aryglandepitheliumandthecharacteristicofeasytoproduceantibiotic-resistantstrains.Thus,avaccinetoprotectagainstinfectionwouldthereforebebeneficial.Inthisreport,162Staphylococcusisol