资源描述：
《克隆柞蚕免疫相关基因克隆和诱导表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、克隆柞蚕免疫相关基因克隆和诱导表达 昆虫免疫主要是以产生的抗菌肽、抗病毒因子、凝集素、溶菌酶及蛋白酶抑制剂等多种活性物质,配合多种功能的血细胞建立的一个开放防御体系.昆虫仅具有先天性免疫,不具有适应性免疫.昆虫的先天免疫系统主要分为细胞免疫和体液免疫2大部分.体液免疫中转录因子Rel/NF-κB介导的信号转导通路主要有Toll通路和Imd通路[1],昆虫主要通过这2种通路抵抗微生物的侵染. 研究发现,这2种通路通过激活不同的Rel/NF-κB家族成员调控不同抗菌肽基因的表达,其中Toll通路主要
2、激活转录因子Dorsal和Dif,Imd通路主要激活转录因子Relish[1-5].已知的Rel/NF-κB蛋白家族成员有8种,哺乳动物中有5种,昆虫细胞中的3种分别是Dorsal、Dif和Relish.其中Dorsal和Dif无锚定重复序列,Relish有锚定重复序列.Rel/NF-κB蛋白的主要功能是调节机体免疫应答、炎症反应、细胞凋亡和生长发育,炎症、癌症、自身免疫疾病等病理过程与NF-κB的过度活化相关[6]. 由于Rel/NF-κB介导的Toll通路与Imd通路在
3、无脊椎动物和脊椎动物中非常保守[1,7],因此,对昆虫Rel/NF-κB的研究不仅能够系统了解昆虫的先天免疫机制,而且可为深入了解高等动物的免疫机制及疾病防治提供重要依据.尽管Rel/NF-κB蛋白在先天免疫过程中起着非常重要的作用,但目前为止尚未见到有关柞蚕Rel/NF-κB家族成员的报道.本项研究利用生物信息学方法和分子生物学技术,以柞蚕蛹为试验材料,克隆柞蚕免疫相关基因Apdorsal的全长cDNA序列,并将其编码的氨基酸序列与其它物种的Rel/NF-κB氨基酸序列进行
4、比对及构建系统进化树,利用实时荧光定量PCR技术检测Apdorsal基因经不同微生物诱导处理后的组织表达变化,为探讨柞蚕的先天免疫机制提供参考. 1材料与方法1.1材料和主要试剂供试柞蚕品种为青6号,柞蚕蛹由辽宁省蚕业科学研究所惠赠,4℃条件下保存备用.大肠杆菌(E.coli)Top10、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)等微生物由本实验室保存.Trizol试剂,ReverseTranscriptaseM-MLV试剂盒,ExTaq酶
5、,凝胶回收试剂盒,pMD18-T载体,T4-DNA连接酶,限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ,RLM-RACE试剂盒,SYBR-PrimeScript-RT-PCRKit(PerfectRealTime),均购自宝生物工程(大连)有限公司. 1.2柞蚕蛹总RNA提取及目的基因的RT-PCR扩增取20μL培养过夜的E.coliTop10,注射到柞蚕蛹体内,12h后解剖取脂肪体组织,用Trizol试剂提取柞蚕蛹脂肪体总RNA,然后按照ReverseTran-scriptaseM-MLV试剂盒说明书将提取的总RNA反转录
6、成cDNA. 根据GeneBank登录的烟草天蛾Dorsal(登录号:ADK39025)、家蚕Rel(登录号:NP_001036896)和冈比亚按蚊Rel(登录号:XP_310177)的cDNA序列设计简并引物F(5′-TGCGARGGMCGSTCGG-3′)、R[(5′-CATKGCCTTCTTRTCG(T/A)AGATG-3′)].简并引物F/R进行cDNA片段扩增,反应条件如下:94℃预变性5min;94℃变性3s,55℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72
7、℃终延伸7min.PCR产物经电泳检测后纯化回收,连接到pMD18-T载体,转化E.coliTop10感受态细胞,通过酶切鉴定筛选阳性克隆,送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序分析. 1.3目的基因的RLM-RACE扩增根据1.2中扩增得到的cDNA序列设计RACE扩增特异引物:Dor-5′RACEouterprimer(5′-CCAGGTTGTGCGAGTGAGGC-3′),Dor-5′RACEinnerprimer(5′-ATTGTAGGGTAGGTGCG
8、GTTCTCG-3′),Dor-3′RACEouterprimer(5′-CTCGGCATCCAGTGCGTCAA-3′),Dor-3′RACEinnerprimer(5′-GGAATCACCCGC-AGAGCATC-3&prime
