牡丹开花相关基因的克隆和表达分析

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分类号UDC密级编号硕士学位论文牡丹开花相关基因的克隆和表达分析CloningandExpressionofFloweringGenesinTreePeony学位申请人：段亚宾指导教师：侯小改教授一级学科：生物学二级学科：植物学学位类别：理学硕士2015年04月 独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期： 摘要摘要牡丹（PaeoniasuffruticosaAndrews.）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（PaeoniaL.）牡丹组（Sect.MoutanDC.）落叶灌木，其花大色艳、芳香浓郁，素有“花中之王”的美称。牡丹观赏栽培历史悠久，种质资源十分丰富。目前国内外共有牡丹1100余品种。但牡丹花期相对集中，各地牡丹品种多以中花品种占优势，早、晚花品种比例很小，大多数牡丹花期为四月中上旬至四月下旬，开花时间一般为15d左右，花期作为牡丹重要的观赏指标之一，其相对集中且时间较短的特点在一定程度上限制了牡丹的发展，因此深入研究牡丹开花的分子机理，对缩短牡丹的童期、加快牡丹育种进程和提高牡丹观赏价值都具有重要的意义。本研究以蔷薇型牡丹品种‘洛阳红’为试验材料，通过电子克隆和同源克隆的方法，采用RT-PCR技术从‘洛阳红’牡丹花芽中成功分离了PsFUL1、PsSOC12、PsAGL15三个开花相关基因，并通过荧光定量法对这三个基因在牡丹不同器官中的时空表达进行了研究。主要研究结果如下：（1）根据本课题组‘洛阳红’牡丹转录组数据，通过构建本地数据库，进行同源序列的本地BLAST，从转录组数据中分离出同源性较高的几条序列信息，经过生物信息学分析后根据这些序列设计特异性引物，通过RT-PCR，从‘洛阳红’花芽中分离出了开花相关基因PsFUL1、PsSOC12和PsAGL15。（2）PsFUL1基因全长1072bp，开放阅读框768bp编码255个氨基酸，属于MADS-box基因家族的AP1/FUL亚家族，具有高度保守的MADS盒和K-box结构域以及AGR80结构域，对PsFUL1蛋白进行生物信息学分析，发现大部分区域为亲水蛋白，二级结构预测显示PsFUL1主要由α螺旋和不规则卷曲构成，NCBI在线比对分析表明PsFUL1与葡萄的AP1类蛋白的同源性最高达到了69%。PsFUL1主要在花芽中表达，在根中表达量低。（3）PsSOC12基因全长957bp，编码199个氨基酸的开放阅读框（长600bp），属于MADS-box基因家族，是开花途径重要的信号整合因子，也是开花促进因子，具有MADS盒和K-box保守结构域以及AGR80结构域，。对PsSOC12蛋白进行生物信息学分析，发现大部分区域为亲水蛋白，二级结构预测显示PsSOC12主要由α螺旋和不规则卷曲构成，NCBI在线比对分析表明PsSOC12与大桉、梅花、野生草莓、葡萄、甜橙的SOC1类基因的同源性高。荧光定量表达发现PsSOC12主要在花芽中表达。（4）PsAGL15基因全长1096bp，开放阅读框741bp编码246个氨基酸，具I 摘要有高度保守的MADS盒和K-box结构域以及AGR80结构域，属于AGL15亚家族，对PsAGL15蛋白进行生物信息学分析，发现大部分区域为亲水蛋白，二级结构预测显示PsAGL15主要由α螺旋和不规则卷曲构成，NCBI在线比对分析表明PsAGL15与荷花的同源性最高达到了58%。同时研究发现PsAGL15在牡丹花芽中表达量较高，在根和叶片中的表达量较低。关键词：牡丹，基因克隆，表达，二级结构预测，实时定量PCR论文类型：基础研究选题来源：NSFC:31370697,31070620国家自然基金项目II ABSTRACTABSTRACTTreepeony(PaeoniaL.)isfamousornamentalflowersreferredtoas‘thekingofflowers’duetotheirrichpaletteofhorticulturalvarietiesanddeepethnobotanicalhistory.Thelarge,showy,colorfulandfragrantflowersareveryattractive.Nowtherearemorethan1,000varietiesundercultivationinChina.TreepeonyisfloweringinthebeginningofAprilandthelateofApril,inthespring.Theblossomtime(about15days)isshortandrelativelyconcentrated,comparedwithotherflowers.Thesecharacteristicslimittheindustrializationdevelopmentoftreepeony.Therefore,itisnecessaryforfurtheranalysisofthemolecularmechanismoffloweringtoshortenthejuvenileperiod,acceleratethegeneticimprovement,andpromotetheornamentalvalue.Inthiswork,theflowerbudsoftreepeonycultivar'LuoyangHong'wereusedasmaterialstoseparatefloweringgenesbyRT-PCR.Finally,thefulllengthcDNAclonesencodingPsFUL1,PsSOC12,PsAGL15weresuccessfullyisolated.TheexpressionprofilesofthreegenesindifferentorgansoftreepeonywereinvestigatedbyqRT-PCR.Theresultsareasfollows:(1)FewhighhomologysequenceswereclonedbybuildinglocaldatabaseandBlastaccordingtothetranscriptomedataoftreepeonycultivar'LuoyangHong'.Specificprimersweredesignedafterthebioinformaticsanalysisoftheabovesequences.Finally,genesPsFUL1,PsSOC12,PsAGL15weresuccessfullyclonedfromtheflowerbudsoftreepeonycultivar'LuoyangHong'byRT-PCR.(2)TheOpenReadingFrame(ORF)ofPsFUL1was768bp,encoding255aminoacids,thatthefulllengthwas1072bpbelongingtoAP1/FULsubfamily.TherewereMADS,K-box,andARG80domainsofPsFUL1.BioinformaticsanalysisofPsFUL1showedthatthemajorityofPsFUL1’sregionwashydrophilicregion,belongingtohydrophilicprotein.PredictionofsecondarystructuresuggestedthatPsFUL1includedmoreirregularαhelixandirregularcoils.ComparedwithotherhomologousAP1/FULaminoacidsequences,itwasfoundthatthemaximumsimilarityofPsFUL1fromvitiswas69%.TheexpressionprofileofPsFUL1showedthatitwasexpressedhigherinbuds,andlowerinroots.(3)TheOpenReadingFrame(ORF)ofPsSOC12was600bp,encoding199aminoacids,thatthefulllengthwas957bp.TherewereMADS,K-box,andARG80domainsofPsSOC12,wasasintegrationfactoroffloweringpathway.BioinformaticsIII ABSTRACTanalysisofPsSOC12showedthatthemajorityofPsSOC12’sregionwashydrophilicregion,belongingtohydrophilicprotein.PredictionofsecondarystructuresuggestedthatPsSOC12includedmoreirregularαhelixandirregularcoils.ComparedwithotherhomologousSOC1aminoacidsequences,itwasfoundthatPsSOC12hadhighsimilaritywitheucalyptus,prunus,fragaria,vitisandcitrus.TheexpressionprofileofPsSOC12showedthatitwasexpressedhigherinbuds.(4)TheOpenReadingFrame(ORF)ofPsAGL15was741bp,encoding246aminoacids,thatthefulllengthwas1096bpbelongingtoAGL15subfamily.TherewereMADS,K-box,andARG80domainsofPsAGL15.BioinformaticsanalysisofPsAGL15showedthatthemajorityofPsAGL15’sregionwashydrophilicregion,belongingtohydrophilicprotein.PredictionofsecondarystructuresuggestedthatPsAGL15includedmoreirregularαhelixandirregularcoils.ComparedwithotherhomologousAGL15aminoacidsequences,itwasfoundthatthemaximumsimilarityofPsAGL15fromnelumbowas58%.TheexpressionprofileofPsAGL15showedthatitwasexpressedhigherinbuds,andlowerinrootsandblades.KEYWORDS:TreePeony,Geneclone,Expression,Secondarystructurepredication,qRT-PCRDissertationType:BasicResearchSubjectSource:NaturalScienceFoundationofChina(NSFC:31370697,31070620)IV 目录目录第1章绪论.................................................11.1引言...........................................................................................................................11.2花发育概述...............................................................................................................11.3光周期途径...............................................................................................................21.4春化途径...................................................................................................................31.5赤霉素（GA）途径.................................................................................................31.6自主途径...................................................................................................................41.7各个途径之间的关系...............................................................................................51.8花发育ABCDE模型...............................................................................................51.9花发育四聚体模型...................................................................................................71.10MADS-box基因.....................................................................................................81.11本研究的目的意义、研究内容目标和技术路线...............................................11第2章材料与方法..........................................152.1材料.........................................................................................................................152.2方法.........................................................................................................................152.2.1总RNA的提取：...........................................................................................152.2.2总RNA的纯化...............................................................................................162.2.3cDNA第一链的合成......................................................................................172.2.4设计引物.........................................................................................................182.2.5牡丹开花相关基因的PCR扩增....................................................................192.2.6PCR扩增产物琼脂糖凝胶回收.....................................................................202.2.7回收产物与载体连接......................................................................................212.2.8转化及阳性克隆筛选：..................................................................................212.2.9质粒提取.........................................................................................................222.2.10生物信息学分析...........................................................................................222.2.11实时荧光定量PCR反应..............................................................................23第3章结果与分析..........................................253.1总RNA的提取、检测与cDNA合成..................................................................253.2牡丹PsFUL1基因的克隆与分析.........................................................................253.2.1牡丹PsFUL1基因的克隆..............................................................................25V 目录3.2.2PsFUL1基因的序列分析...............................................................................263.2.3PsFUL1同源性比较与系统进化分析...........................................................293.2.4PsFUL1的表达分析.......................................................................................323.3PsSOC12基因的克隆与分析................................................................................323.3.1PsSOC12基因的克隆.....................................................................................323.3.2PsSOC12基因的序列分析.............................................................................333.3.3PsSOC12同源性比较与系统进化分析.........................................................373.3.4PsSOC12的表达分析.....................................................................................393.4牡丹PsAGL15基因的克隆与分析.......................................................................403.4.1牡丹PsAGL15基因的克隆............................................................................403.4.2牡丹PsAGL15基因的序列分析...................................................................413.4.3PsAGL15同源性比较与系统进化分析.........................................................443.4.4PsAGL15的表达分析.....................................................................................443.5讨论.........................................................................................................................463.6小结.........................................................................................................................46第4章结论................................................49缩略语词汇表...............................................57附录.......................................................59致谢.......................................................65攻读学位期间的研究成果.....................................67VI 第1章绪论第1章绪论1.1引言牡丹（PaeoniasuffruticosaAndrews.）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（PaeoniaL.）牡丹组（Sect.MoutanDC.）落叶灌木，牡丹组野生种9个均为中国特有，栽培品种也起源于中国，世界各地的牡丹均直接或间接从中国引进。牡[1]丹花大色艳、芳香浓郁，素有“国色天香”、“花中之王”的美称。牡丹观赏栽培历史悠久，长期的自然和人工选择，加之繁殖方式多样，牡丹种质资源十分丰富。目前国内外共有牡丹1100余品种。中国栽培牡丹主要有中原品种群、西[1]北品种群、西南品种群、江南品种群以及国外品种群。牡丹花期相对集中，各地牡丹品种多以中花品种占优势，早、晚花品种比例很小，大多数牡丹花期为四月中上旬至四月下旬，开花时间一般为25d左右，花期作为牡丹重要的观赏指标之一，其相对集中且时间较短的特点在一定程度上限制了牡丹的发展，因此深入研究牡丹开花的分子机理，对缩短牡丹的童期、加快牡丹育种进程和提高牡丹观赏价值都具有重要的意义。1.2花发育概述开花是植物生长发育过程中营养生长向生殖生长转变的重要过程，一般来说，植物成花发育涉及不同发育阶段，即花序发育（自身和环境因素共同诱导下植物由营养生长转向生殖生长形成花序分生组织），花芽发育（由花序分生组织逐步形成），花器官发育（花分生组织产生花器官原基）和花型发育（雌蕊、花药等的成熟过程），其中花序发育标志着植物成花启动，其也是花器官形成的基[2,3]础，决定着植物的开花时间。随着分子生物学技术的不断发展，从模式植物拟南芥中克隆分离出大量的开花相关关键基因，深入研究这些基因的功能后，人们对植物开花调控的分子机制也有了更深入的认识。根据这些基因在拟南芥中的开花调控作用方式，目前已确定4条开花调控信号途径，即光周期途径（Photopedodpathway）、春化作用（(Vernalizationpathway）、自主途径[4-6]（Autonomouspathway）、赤霉素（GA3）途径（Gibberelinpathway），其中光周期途径和春化途径分别对环境中的光信号和低温信号做出反应，而自主途[5,7]径和赤霉素途径主要受植物自身内部发育状况和内源激素水平的影响。此外，群体密度、营养、胁迫条件、病害等因子也影响植物的开花。调控植物开花时间的4条信号途径均能激活一套开花途径整合因子从而激活1 河南科技大学硕士学位论文花分生组织特异基因启动开花。主要的开花途径整合因子有CO(CONSTANS)、FLOWERINGLOCUST(FT)、LEAFY(LFY)和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)，然后激活花分生组织特性基因如APETALA1(AP1)、FRUITFUL(FUL)、SEEPALLATA4(SEP4)等使茎端分生组织转化为花序分生组织，而花器官特征基因决定花原基形成不同的花器官，从而形成形态多样的花。1.3光周期途径光周期反应是自然界中普遍存在的现象，是生物体对日照长短的昼夜节律变化做出的响应。光周期影响种子的萌发、幼苗的生长、根系的生长、内含物的积累、植物休眠等生长发育过程，其中最重要的是对植物成花诱导的影响。根据植物开花时间与日照长度的关系，将其分为长日照植物、短日照植物和中日照植物。如拟南芥在长日照条件下出现早花，随日照时间的缩短开花时间延迟。烟草在夏天长日照条件下只进行营养生长在高为3-5m时依然不开花，但在冬天短日照条件下在高不足1m时即可开花。这些现象说明光周期影响植物开花。研究发现光周期途径中，光信号被植物光受体感应后，先传递给“生物钟”，然后“生物钟”将检测到的日照长度信号传递给下游基因，调控开花促进基因的表达，降解开花抑制因子，接着花分生组织特性基因表达升高诱导开花，从而实现日照长度对开花时间的调控。（1）光受体光受体是植物体内感受光的物质，根据吸收光谱的不同可分为光敏色素和隐花色素，其中光敏色素感受红光和红远光，隐花色素则感受蓝光和紫光。光受体PHYA和CRY2感受日长和夜长产生昼夜节律，这时光受体本身或与其有关的一些物质之间形成某种平衡，当日照或夜长发生变化破坏了这种平衡时促进或抑制开花的基因表达从而启动或抑制开花过程。光敏色素和隐花色素通过吸收光谱调[8]节植物发育，如拟南芥中光受体PHYA过量表达可使开花提前，PHYB的突变体形成早花，说明PHYA和PHYB分别起开花促进和开花抑制作用，蓝光受体[9]CRY2在长日照条件下促进开花。（2）生物钟生物钟是指生物体内产生的以接近24h为一个周期的生物节律自发机制，即通过昼夜节律的调控来调节植物的生理活动，生物钟控制着光合作用活性、叶片的运动、细胞生长和基因表达的日常变化。生物钟是环境反应通路调控的目标，其光信号来自光敏色素，光周期信号通过生物钟输入，控制开花相关基因的转录2 第1章绪论产物随昼夜节律而发生周期性变化，并影响其他周期性调节过程。（3）光周期途径下游基因CO是光周期调控中的关键基因，也是最早鉴定的受节律调节影响开花的基因，其编码具有两个B-box类型锌指结构的转录因子。拟南芥中co突变体在短日照条件下正常开花，而在长日照条件下开花延迟，说明在长日照条件下CO是拟南芥的开花促进基因。同时研究发现该基因转录水平具有昼夜节律性，长日照条件下CO表达量最大值分别出现在黎明后16h和24h，而短日照时CO的表达量高峰出现在夜间，且mRNA的丰度比长日照条件下低，因此推断CO表达的昼夜规律是由节律钟控制的。但CO基因只是一个转录因子，它并不能直接促进[10]植物开花，而是通过激活下游基因FT进而促使植物成花。成花素FT蛋白是可移动的信号分子物质，它在子叶和叶脉中合成，可以从叶片通过韧皮部移动到茎尖分生组织，与转录因子FD互作，共同激活花分生组织基因AP1，SOC1等[11,12]从而促进开花。1.4春化途径冬性及二年生植物在营养生长初期经过一定时间的低温处理能诱导开花，低温（4℃，2-8周）诱导植物开花的过程称为春化作用。春化作用并不改变植物的基因，不具有遗传性，可通过有丝分裂在当代植株中保持稳定，但不能通过有[13,14]性生殖传递给后代。春化作用并不直接导致开花，而是在很大程度上加速了开花的进程。春化作用的感受位点是植物的根尖和茎尖，只有具有分裂活性的细胞才能对春化作用做出反应。拟南芥中，FRI、FLC、VRN1(Vernalization1)、VRN2等基因与春化作用相关。其中FLC是春化作用中的关键基因，也是开花抑制因子，抑制拟南芥开花。拟南芥非春化需求型早花种类中，FLC的表达量明显低于春化需求型晚花种类，表明FLC直接参与春化作用。同时研究发现春化作用主要是通过改变部分区段的染色质结构使FLC关闭进而解除该基因对植物开花的抑制。FRI蛋白可促进FLC的表达，具有抑制植物开花的作用。而[14]VRN1、VRN2基因被春化作用激活后可以促进拟南芥开花。1.5赤霉素（GA）途径赤霉素作为植物茎伸长所必需的激素物质，对植物开花也有重要作用。如拟南芥经赤霉素处理后可以提前开花。研究发现赤霉素可以调控植物开花时间，同时参与种子萌发、茎干伸长等植物生长发育过程。GAI(GIBBERELLICACIDINSENSITIVE)、RGA(REPRESSOROFGAI-3)、RGL1(RGA-LIKE1)作为赤霉素信3 河南科技大学硕士学位论文号传导途径中的3个关键基因，均属于植物特异调控蛋白中的GRAS(GAI、RGA、SCARECROW)家族，它们的功能部分冗余，当GA缺乏时都负调控GA信号途径，而活性GA则能消除它们的抑制作用。同时它们的N端均有一个特异的保守的DELLA结构域，DELLA蛋白位于细胞核中，能抑制植物开花，因此[15]这三个基因中的任何一个发生突变，均可导致植物提前开花。同时研究发现GA具有解除DELLA蛋白对植物开花的抑制作用，当赤霉素含量很少时，DELLA蛋白抑制植物生长发育，但当接收GA信号后这种蛋白的抑制作用被解除，植株就可表现出正常的GA反应和生长发育。研究证实，在赤霉素生物合成途径突变体中，由于赤霉素合成途径的打断减少了对GAI、RGL1、RGA的抑制[16]作用从而导致植物开花时间推后。PHOR1蛋白是赤霉素信号途径中的另一个重要原件，具有高度保守结构域，能与泛素系统蛋白相互作用。当赤霉素存在时，泛素系统蛋白通过与GAI/RGA蛋白的DELLA域相互作用使PHOR1蛋白降[17]解，从而激活下游基因SOC1的表达。1.6自主途径外界环境因子对植物开花的诱导可使植物在较适宜的环境下开花，但当缺乏这种诱导时，有些植物在营养生长到一定阶段后也能开花。如经低温处理的冬小麦85天后可开花，若不经低温处理，当生长到150天左右时冬小麦依然可以部分开花。拟南芥在条件不适宜的情况下晚点也能开花，这些现象说明植物体内存在着控制开花的自主途径，其对光周期或春化途径信号不敏感，也不依赖于环境因素，主要是通过感受植株内部的发育状态如年龄、大小等，依靠体内各基因间的相互拮抗和协同作用使植物生长到一定阶段后开花。研究发现拟南芥突变体如ld、fpa、fca、fve、fy在长日照和短日照条件下均比野生型开花晚。这些基因是[18]通过抑制FLC的表达从而促进拟南芥开花。LD、FCA、FY、FLD、FPA、FVE、FLK是拟南芥自主途径中的重要基因，与RNA修饰或染色质修饰有关。其中LD是最早分离的自主途径基因，在植物各个组织中均表达，尤其是茎尖和[17]根尖的表达量最高。它们中的任何一个基因发生突变就会产生晚花现象。自主途径的作用主要是通过减少FLCmRNA的积累来促进开花。研究发现FCA和FY两个自主基因共同调控成花基因的表达，FLD和FVE对FLC位点的染色质进行后期修饰，使FLC染色体组蛋白去乙酰化后FLC蛋白失活，从而促进植物[19]开花。4 第1章绪论1.7各个途径之间的关系4个途径不是孤立的，而是根据植物自身生长发育状况和外界环境条件相互联系相互作用。它们通过共同的下游靶基因整合成植物开花调控途径。研究发现拟南芥中有3个整合基因SOC1、FT和LFY。光周期途径和GA均能直接作用于LFY的启动子，FLC能通过抑制顶端GA的活性推迟植物开花，SOC1受CO、FLC和GA途径的调控，是是4条开花途径的交叉点。AP1是植物开花的直接相关基因，与SOC1具有相互条件作用。经过SOC1、FT和LFY3个花分生组织特性基因的整合，4条开花途径形成了一个严密的调控体系，最大程度上优化了植[20]物生长发育的需求。1.8花发育ABCDE模型模式植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）和金鱼草（Antirrhinummajus）是研究花发育模型的重要实验材料。Coen等学者通过研究拟南芥（Arabidopsisthaliana）和金鱼草（Antirrhinummajus）的花同源异型突变体，提出了花发育的[21]ABC模型。模型认为四轮花器官萼片、花瓣、雄蕊和心皮的形成分别由A、B、C3类同源异型基因控制，其中萼片的形成由A类基因AP1和AP2负责，B类基因主要包括AP3和PI(PISTILLATA)，花瓣的发育由A类和B类基因共同控制，C类基因AGAMOUS(AG)与B类基因共同控制雄蕊的形成，其单独控制心皮的形成，ABC模型不但解释了花同源异型基因调控花器官的形成，还阐明了野生型和各种突变体的成因，但花器官间的嵌合体现象却无法解释。负责胚珠发育的FBP7(FLORALBINDINGPROTEIN7)和FBP11两个基因被Angenent等人从模式植物矮牵牛中克隆得到后，研究发现FBP11超表达时矮牵牛的萼片和花[22]瓣变成胚珠，因此D类基因FBP7和FBP11决定胚珠的发育。研究发现拟南芥中与矮牵牛FBP11同源的D功能基因是STK(SEEDSTICK)，和AG有较近的亲缘关系、相似的表达模式，同时发现D功能基因SHP1(SHATTERPROOF1)[23]和SHP2与AG、STK互为冗余共同控制着胚珠的发育。研究发现通过调控ABC基因的协同表达除了无法使叶片转变成花器官，可以人为地操控每轮花器官的发育状态。这一现象说明还有其它花器官基因参与了营养器官向花器官转变的过程。酵母双杂交实验发现SEP1(SEPALLATA1)、SEP2和SEP3基因的三重突变体表型与B、C类基因的突变体表型相似，但B、C类基因的表达未发生变化，B和C类双突变体中上述三基因（SEP1、SEP2、SEP3）仍有表达，这说明SEP基因和B、C类之间无上下游关系。进一步的研究发现AG的下游基因SHP2能被SEP的蛋白复合体激活从而完成花器官的发育。如SEP3与B、C类5 河南科技大学硕士学位论文[24]基因协同表达能使叶片转变成雄蕊。新的研究发现拟南芥SEP4基因在拟南芥四轮花器官中均表达，而sep4单突变体无表型变化，sep1sep2sep3sep4四重突变体的花同源异型则转化为叶片类器官，这与缺少A、B、C类基因的三重突变体表型相似，说明SEP功能基因控制花分生组织的形成，参与调控四轮花器官[25,26]的形成，因此命名SEP基因为E类基因。据此ABC花发育模型完善修正为目前广为接受的ABCDE模型，该模型认为：A、B、C、D、E类基因相互作用共同控制花器官的形成。其中A类和E类基因主要负责萼片（花器官第一轮）的形成，B类和A、E类基因活性共同控制花瓣（花器官第二轮）的发育，B、C类和E类基因活性共同控制雄蕊（花器官第三轮）的形成，C、E类基因活性共同控制心皮（花器官第四轮）的形成，D、E类基因决定胚珠的发育。五类基因任何一个的缺失都将导致相邻的2轮花器官发生改变，如A类基因对C类基因有抑制作用。金鱼草中A类、B类、C类基因主要指SQUA(SQUAMOSA)、GLO(GLOBOSA)和DEF(DEFICIENS)、PLE(PLEA)，FBP7和FBP11是矮牵牛中的D类基因。ABCDE模型从基因水平阐述了植物花器官分化和发育的机理，但由于花器官分化和发育是一个非常复杂的过程，所以它既受不同基因之间相互作用的影响，外界环境信号对花发育也有调控作用，如温度、激素、叶片等，因此还需进行更多更深入的研究。BclassAP3/PIAclassCclassAP1/AP2AGDclassAGL11EclassSEP1/SEP2/SEP3/SEP4萼片花瓣雄蕊心皮胚珠图1-1拟南芥花器官发育的ABCDE模型及相关基因Fig.1-1ABCDEmodelandrelatedgeneoffloralorganofArabidopsis6 第1章绪论1.9花发育四聚体模型酵母杂交、过量表达等大量分子生物学实验发现花的同源蛋白首先通过聚合[27,28]作用形成同源（异源）二聚体然后再组装形成多聚复合体发挥作用。随后Zahn等完善补充Theissen等提出的“四因子”模型从蛋白质水平上阐述了花器官的形成机理。该模型的主要内容是花器官身份决定是由A、B、C、D、E类基因的蛋白质产物相互之间形成4种同源异型蛋白复合调控花器官的形成与发育[29-31]。首先蛋白复合体结合在目标基因的启动子区，然后通过调控基因的开闭来调控花发育，同源或异源二聚体首先特异地结合在同一条DNA相邻的CArG-box(5-CCA/TGG-3)上，2个二聚体单位再通过C末端结合形成四聚体，然后DNA分子弯曲靠近，最后再通过激活或抑制靶基因的表达从而调控花器官发育。如拟南芥中AP1-AP1-SEP-SEP四聚体控制第一轮花器官萼片的形成，AP1-AP3-PI-SEP四聚体负责第二轮花器官花瓣的形成，AP3-PI-AG-SEP四聚体控制第三轮花器官雄蕊的形成，AG-AG-SEP-SEP四聚体负责心皮的形成，SHP-STK-[32]AG-SEP四聚体控制胚的形成。萼片花瓣AP1AP1AP1AP3SEPSEPSEPPI雄蕊心皮AGAP3AGAGSEPPISEPSEP图1-2花器官发育的四聚体模型，四个蛋白质的复合体决定花器官发育Fig.1-2Tetramermodelandfourproteincomplexesofflowerorgan7 河南科技大学硕士学位论文1.10MADS-box基因（1）MADS-box基因的来源MADS-box基因是一类具有共同保守结构域在生物中广泛存在编码转录因子的基因家族。它的命名是由最初发现的四个物种的基因的首字母组成，分别是酿酒酵母中的转录因子MCM1(MINICHROMOSOMEMAINTENANCE1)，拟南芥中的花同源异型基因AG，金鱼草的花同源异型基因DEF和人类中发现的血清应答因子SRF(SERUMRESPONSEFACTOR)。MADS-box基因广泛地分布在动物、植物和真菌中，其编码的转录因子调控真核生物的生长发育和信号转导过程[33]，近年来MADS-box是研究花发育的热点问题，特别是其如何调控植物花器官的分化、开花时间的控制和果实发育与成熟等方面。（2）MADS-box基因的结构和分类MADS-box基因遍布植物界分散于整个基因组，目前已从拟南芥中分离得到了107个MADS-box基因，水稻中大约分离得到了75个MADS-box基因。为了便于研究该基因家族的进化史及各基因功能，Alvarez-Buylla等将MADS-box基因家族分为I型(TypeI)和II型(TypeII)两类，拟南芥和水稻中约有40个TypeIIMADS-box基因分布在不同的染色体上。目前TypeIIMADS-box基因研究的较为透彻而TypeIMADS-box基因的功能仍未深入研究，其中TypeI基因只含有MADS-box保守区，而TypeII基因具有保守的MIKC结构域，即MADS-Intervening-Keratin-Cterminal4种蛋白结构域。这四个结构域保守性并未完全一致又各自发挥着不同作用。其中高度保守的M结构域由57个氨基酸组成位于基因的N端。研究发现M区编码DNA结合域的转录因子，作为调节蛋白质的结合单元具有DNA结合和形成二聚体的作用。M结构域由反向平行折叠的α螺旋基元形成了特定二聚体结构，其又与DNA小沟相互作用，将MADS蛋白与DNA的保守序列结合位点称作CArG盒[CC(A/T)6GG]。M之后的I结构域一般由30个氨基酸组成，但其长度变化不定。研究结果表明I区域对某些MADS蛋白的二聚体结构形成起决定性作用，既可以帮助二聚体转录因子与DNA结合成复合体，又可以决定哪个MADS盒二聚体可与DNA结合。随后的K结构域是植物转录因子的特征性结构具有较高保守性。K结构域大约由70个氨基酸组成其中多为疏水性氨基酸。其编码的蛋白质结构类似于角蛋白的卷曲状结构，可形成亲水性的α螺旋，K结构域的主要作用是调节蛋白质与蛋白质的相互作用促进形成二聚化。K下游的C结构域由30个疏水氨基酸组成是MADS-box基因的[34]转录激活区，但其保守性很低。MADS-box基因的功能多样，调控开花时间、决定分生组织和花器官的形成，参与营养生长、种子发育、抗逆性表达等过8 第1章绪论[35-39]程，因此可以将MADS-box基因分成12个亚家族，分别是AG、AGL6、AGL12、AP3/PI、GGM13、STMADS11、TM3、AGL2(SEP)、AGL17、AP1/SQUA、AGL15和FLC亚家族，根据花同源异型基因的深入研究又可将12个亚家族分成四大类，即AP1/FUL-like（A类），AP3/PI-like或DEF/GLO（B[40]类）、AG-like（C/D类）和SEP-like（E类）。（3）MADS-box基因ABCDE类基因研究进展拟南芥中A类基因主要包括AP1、CAL、FUL、AGL79和AP2，它们在花发育的进程中扮演着不同的角色，还与营养器官的形成有关。其中AP1作为花分生组织的特异基因调控花序分生组织向花分生组织转变，其表达缩短了植物的营养生长期，促进植物提前开花，同时AP1作为花器官的特异基因决定着萼片和花瓣的形成。拟南芥中AP1基因属于花分生组织决定基因，光诱导16h后进[41]行表达，拟南芥中的AP1基因也会促使花第一轮萼片的形成，其在拟南芥中[42]过表达会导致花器官畸形，并能促使营养期向花序分生组织形成的转变和最[43][44][45][46][47][48]终花的发育。目前已从小黑杨、葡萄、芥菜、草莓、建兰、山核[49][50][51][52][53]桃、芒果、荔枝、龙眼、荷花等植物中克隆得到了AP1的同源基因。小麦中克隆得到的AP1/FUL-Like基因WFUL1、WFUL2和WFUL3，WFUL1在未春化小麦的叶和生长点表达，与生长阶段转变关系密切，WFUL2在[54]花器官的内稃和外稃中表达，WFUL3在整个花器官中均表达。CAL只具备AP1基因的部分作用，对花分生组织的形成有促进作用，但FUL作用范围广，在花发育早期对形成花序分生组织有促进作用，晚期表达于心皮、幼内角果中，还调节叶片的形态建成。具有AP2特定结构域的AP2基因作为植物花发育中的重要参与因子不仅参与植物的生长、发育，参与多种生理生化反应，还参与植物[55][56]花分生组织的建立并控制萼片和花瓣的形成。目前已从花生、白桦、毛桃[57][58][59][60]、油菜、毛竹、木薯植物中克隆得到了AP2同源基因的全长cDNA。大量研究发现AP2是目前唯一不属于MADS-box的基因家族成员，它可能是通过MADS-box蛋白协调作用参与了花器官发育的调控。B类基因PI和AP3主要负责花瓣和雄蕊的发育。研究发现AP3/PI的活性在拟南芥花发育过程中呈时间和空间上的不同，说明它们在花发育不同阶段对不同的表达进行控制，同时也发[61]现AP3/PI基因参与雄性器官发育的激活和雌性器官发育的抑制。目前已从文[62][63][64][65][66]心兰、辣椒、蜡梅、葡萄、陆地棉植物中克隆出了PI的同源基因。AG作为C类基因主要控制雄蕊和心皮的发育。如研究发现PeMADS1和[67][68][69]PeMADS7在兰花合蕊柱和子房发育中起作用。目前已从梅、蕙兰、叶子[70][71][72]银杏、百合、月季等植物中克隆出了AG的同源基因。控制胚珠发育的9 河南科技大学硕士学位论文基因叫做D功能基因，拟南芥中的D功能基因是STK，对胚珠、种子的形成和[73][74]发育有重要作用，SHP1和SHP2均表达于胚珠、雌蕊和角果中，FBP7和FBP11作为矮牵牛中的D功能基因异位表达时可使萼片和花瓣上长出胚珠。榛树中的SHP同源基因MADS1主要表达在心皮和胚珠中，雄花内也有少量表达。而E类基因SEP基因与B、C类基因形成复合转录因子控制花瓣、雄蕊、雌蕊等的形成，同时SEP基因的表达可以缩短植物的营养生长周期从而促进植物提[75][76][77][78][79][80]早开花。目前已从水稻、桃、百合、悬铃木、豌豆、枣等植物中克隆得到了E类功能基因。（4）MADS-box基因的功能植物中MADS-box基因不仅调控了植株从营养生长到生殖生长的转换、对光周期的反应、激素信号转导、开花时间、花器官的形成、花粉的发育和育性[81]等，还参与了植物生长发育的其它方面如根的生长发育甚至根瘤的形成，顶[82][83][84]端分生组织的分化、果实的发育、成熟和开裂等过程。拟南芥中促进开花的基因主要有AGL20、AGL24、CO、SOC1等，抑制开花的基因主要有FLC、FLM、FRI、SVP等。十字花科植物中分离出的AGL20基因当其过量表达时会使得植物开花提早很长时间，而该反义基因转化植物后出现[85]开花严重推迟的现象。agl24的突变体会使植物开花时间推迟，而AGL24的过量表达会使植物开花时间提前。AGL24mRNA受春化作用的正向调控，但不受FLC基因的影响。COmRNA在无性繁殖阶段呈渐进方式积累，当达到一定阈值时显著地促进TFL和LFY的表达，同时其也具有直接促进花发育的作用[86]。Moon等研究发现gal-3突变体在短日照条件下不开花，但当采取措施SOC1表达量升高时植物会开花。SOC1受赤霉素的正向调控，短日照条件下，用GA处理野生型植物后植物提前开花，同时SOC1的表达水平也上升，这一现象被认为是SOC1促进了植物开花。而FLC是第一个被鉴定出来的开花抑制因子，其对开花的抑制程度与其剂量成正比，其表达量不受赤霉素影响，但受春化作用和自主途径的正向调控，同时去甲基化对其起负调控作用。FRI是开花推迟的主要抑制因子，Michaels等发现在野生型的晚花植物中，FRI会提高FLC的[87]水平，Johanson等在拟南芥中研究发现FRI基因的变化是开花时间变化的决定子之一，显性的FRI基因会使植物出现晚花表型，大部分早花植物由于携带的FRI基因有部分缺失，使得正常的阅读框架遭到破坏抑制从而产生早花表型[88]。而SVP的转录产物仅局限于营养器官和花原基中，成熟的花中并未发现[89]。胚珠是种子植物特有的器官，经受精后发育成种子，研究发现MADS-box10 第1章绪论基因中与胚珠发育相关的基因有很多，如矮牵牛中的FPB7和FPB11，拟南芥中的STK、SHP、SEP，水稻中的OsMADS13，风信子中HoMADS1，百合中的LMADS2和EgMADS1等基因，研究发现SHP1和SHP2同STK在促进胚珠特性方面功能是冗余的，stkshp1shp2三重突变体中，胚珠和种子的发育被打乱，一[90]些胚珠转变为叶状或心皮状的结构，HoMADS1过量表达会产生心皮状的器官和胚珠，LMADS2主要在胚珠中表达，心皮中有较弱表达，而EgMADS1在胚珠[91]中特异表达。近些研究发现MADS-box基因在果实发育和成熟中也具有重要作用。如番茄中的LeMADS-RIN基因主要在果实中表达，其表达量随果实成熟度而增加[92]，香蕉中的MuMADS1基因表达受外源乙烯和乙烯合成物的诱导，与果实成熟密切相关，桃中克隆分离的C类MADS-box基因PLENA在果实成熟过程中表达量不断增加，在番茄中异位表达后萼片转为类似心皮的结构最终形成浆果[93][94]。葡萄中的VvTM6基因参与果实的的发育和成熟，菠萝中的MADS-box基[95]因参与了果实的发育和成熟过程。研究发现MADS-box基因具有多重功能，如FUL基因可以调控开花时间，参与调控芽顶端分生组织向花分生组织的转变，在拟南芥中也控制莲座叶和茎生叶的发育，通过影响维管束的发育调控叶片的形状，同时可以控制角果的伸长和[96]开裂。矮牵牛AGL15亚家族的PMADS9基因既是开花抑制因子，参与赤霉素[97]调控途径，影响植物胚发育，同时对花卉和种子有延缓衰老的作用。1.11本研究的目的意义、研究内容目标和技术路线（1）目的意义牡丹作为我国的十大名花，其栽培历史悠久，品种繁多，花期作为牡丹最重要的观赏价值之一，其时间长短和时间分布直接关系到牡丹的观赏价值和商业价值，但我国各地牡丹品种多以中花品种占优势，早晚花品种比例很小，因此研究牡丹花期的分子机理，不仅对于牡丹分子机理具有重要的理论价值，而且还对牡丹进行花期调控、促成栽培（春节催花）、实现牡丹周年开花，指导延长牡丹观赏时间等方面具有重要意义。（2）研究目标目前从牡丹中克隆分离出的开花相关基因有PsAP1、PsAP2、PsPI、PsMADS1、PsMADS9、PsAG、PsMADS5和PesTM6-1、PesTM6-2，但并不完整，本试验采用RT-PCR和实时定量PCR对牡丹开花相关基因PsFUL1、11 河南科技大学硕士学位论文PsSOC12、PsAGL15进行同源克隆和表达分析，研究各基因在‘洛阳红’根、叶、花芽、苞片、花瓣中的时空表达并对其进行分析，为牡丹花期调控奠定基础。（3）主要研究内容A：根据GenBank登录的其它物种MADS-box功能基因的mRNA信息和本课题组牡丹‘洛阳红’的转录组数据，通过BioEdit软件构建数据库进行本地BLAST，获得具有MADS结构域和K结构域且与其它MADS-box功能基因相似系数高的序列，经过生物信息学分析后设计特异性引物，通过RT-PCR（reversed-trancriptPCR）获得目的基因片段，测序后分析序列信息并登录在GenBank。同时对分离得到的基因所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析，对其系统进化、编码的蛋白质类型、理化性质等信息进行初步探测，并预测其功能。B：采用Real-timePCR技术，对PsFUL1、PsSOC12、PsAGL15基因在‘洛阳红’根、叶、花芽、苞片、花瓣中的时空表达进行分析，为牡丹花期调控奠定基础。（4）技术路线本研究采用的主要技术路线（图1-3），主要通过电子克隆和同源克隆的方法，利用RT-PCR从牡丹花芽中分离出PsFUL1、PsSOC12、PsAGL15基因，然后通过Real-timePCR对这些基因的时空表达进行分析，为牡丹花期调控奠定基础。12 第1章绪论‘洛阳红’花芽总RNA的提取开花基因的电子克隆、引物设计Reversed-TrancriptPCR牡丹开花基因片段获得序列生物信息学分析‘洛阳红’不同部位RAN提取荧光定量PCR确定开花基因的时空表达图1-3研究技术路线Fig.1-3Technicalrouteofresearch13 河南科技大学硕士学位论文1414 第2章材料与方法第2章材料与方法‘洛阳红’是洛阳栽培种植最为广泛的传统品种，也是最主要的催花品种，其花为紫红色，蔷薇型，有时为蔷薇台阁型，生长势、分枝力强，成花率高，是重要的栽培品种，也是我们研究牡丹的主要试验材料。本章采用RT-PCR技术从牡丹品种‘洛阳红’的花芽中扩增出与开花相关基因的cDNA序列，并对其进行了理化性质的分析。2.1材料植物材料：2013年四月中旬采收种植多年的牡丹品种‘洛阳红’盛花期时的花瓣、苞片、叶和根，2013年10月采收‘洛阳红’的花芽，锡箔纸包装后置于-70℃冰箱保存。实验仪器及试剂：超低温冰箱，低温冰箱，双蒸水仪，湘仪高速离心机，高速冷冻离心机，超级工作台，水浴锅，PCR仪，荧光定量PCR仪器，凝胶成像仪，摇床，培养箱，分光光度计，镊子，涂布器等。CTAB、PVP40、DEPC、β-巯基乙醇、SDS、NaCl、EDTA-Na2、Tris、NaOH、HCl、LiCl、氯仿、异戊醇、乙醇、硼酸均为国产分析纯，购自北京索莱宝公司，RT-PCR所用试剂中，DNase(RNasefree)、反转录试剂盒TMPrimeScriptII1ststrandcDNASynthesisKit，DL2000Marker、pMD-18T载体、氨苄青霉素、切胶回收试剂盒MiniBEST、DH5α感受态细胞、高保真ExTaq酶购自大连宝生物试剂公司，TIANGEN的荧光定量试剂盒、核酸染料GELVIEW购自北京百泰克公司，琼脂糖、琼脂、酵母提取物与胰蛋白胨等药品为进口或国产分析纯试剂。2.2方法2.2.1总RNA的提取：采用改良的CTAB法提取总RNA，具体操作步骤如下：（1）取牡丹花芽1g左右于预冷的加有液氮的研钵中，快速研磨成白色粉末然后将粉末装入10ml离心管中；（2）加入3ml65℃预热的CTAB和90μlβ-巯基乙醇剧烈震荡5分钟使粉末完全分散在CTAB缓冲液中，将离心管置于65℃水浴锅中10分钟，期间每隔两15 河南科技大学硕士学位论文分钟剧烈震荡一次；（3）高速冷冻离心机离心18℃10000rpm15分钟；（4）吸取上清液于另一支10ml离心管中，加入等体积的24:1氯仿/异戊醇，剧烈震荡5分钟使溶液充分混匀，高速冷冻离心机离心18℃10000rpm15分钟；（5）重复上一步；（6）将步骤5）的上清液转移至3号10ml离心管中，加入1/4之一体积的10molLiCl，混合均匀置于4℃冰箱过夜。（7）高速冷冻离心机离心4℃10000rpm20分钟然后弃去上清液，加入3ml70%的乙醇漂洗沉淀，手指轻弹使沉淀浮起来；（8）高速冷冻离心机离心4℃10000rpm20分钟然后弃去上清液，将3号离心管放入超净工作台吹无菌风，沉淀稍干即可；（9）向离心管中加入60℃预热的SSTE缓冲液250μl溶解RNA，并将溶液转移至4号1.5ml离心管中，冲洗3号离心管一次；（10）水浴4号离心管60℃1分钟使液体澄清；（11）向4号离心管中加500μl24:1氯仿/异戊醇，剧烈震荡5分钟，高速冷冻离心机离心18℃10000rpm10分钟；（12）将上清液转至5号离心管，加2倍体积的预冷无水乙醇，置于-70℃2小时以沉淀RNA；（13）高速冷冻离心机离心4℃10000rpm10分钟然后弃去上清液，加入500μl70%的乙醇漂洗沉淀，手指轻弹使沉淀浮起来；（14）高速冷冻离心机离心4℃10000rpm10分钟然后弃去上清液，将5号离心管放入超净工作台吹无菌风，沉淀稍干即可；（15）向5号离心管加100μlRNasefreeddH2O溶解RNA，-70℃保存。2.2.2总RNA的纯化按DNaseI(RNasefree)说明书去除总RNA中的DNA，具体操作步骤：（1）在1.5ml离心管中配制表2-1反应液后37℃反应30分钟；（2）加入2.5μl0.5MEDTA80℃反应2分钟，然后用RNasefreeddH2O补足至100μl；（3）加入10μl3M醋酸钠和250μl预冷无水乙醇，冰浴10分钟；（4）高速冷冻离心机4℃10000rpm15分钟弃上清后，加入70%乙醇漂洗沉淀，轻弹使沉淀浮起；16 第2章材料与方法（5）高速冷冻离心机4℃10000rpm15分钟弃上清，在超净工作台吹无菌风干燥沉淀;（7）加入50μlRNasefreeddH2O溶解沉淀，-70℃保存，用1%琼脂糖凝胶检测是否去除基因组DNA。表2-1RNA纯化反应混合液Table2-1ThemixtureofRNApurificationreaction试剂用量总RNA20-50μg10×DNaseIBuffer5μlDNaseI(RNasefree,5U/μl)2μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μlRNasefreeddH2Oupto50μl2.2.3cDNA第一链的合成（1）配制cDNA合成第一步反应液（表2-2）后在PCR仪中65℃反应5分钟后立马置于冰上；表2-2cDNA合成第一步反应液Table2-2ThefirststepmixtureofcDNAsynthesisreaction试剂用量OligoDtPrimer(50μM)1μlDntpMixture(10mMeach)1μlTemplateRNA(TotalRNA)20μgRNasefreeddH2Oupto10μl（2）配制cDNA合成第二步反应液（表2-3）轻弹混合均匀后在PCR仪中进行下列反应：17 河南科技大学硕士学位论文30℃反应10分钟，42℃反应50分钟，95℃反应5分钟，反应结束后用1%琼脂糖凝胶检测，产物于-70℃保存。表2-3cDNA合成第二步反应液Table2-2ThefirststepmixtureofcDNAsynthesisreaction试剂用量TotalRNAandPrimerMixture10μl5×PrimerScriptIIBuffer4.0μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μlPrimerScriptIIRTase(200U/μl)1.0μlRNasefreeddH2Oupto20μl2.2.4设计引物（1）根据‘洛阳红’转录组数据，利用关键词如DEF基因全称如deficiens分别在蛋白质注释文件NR和核算注释文件NT中寻找相应序列编号，然后从5-3序列文件夹寻找相应序列信息，重点比较NR和NT中找到的不同的序列信息；（2）用BioEdit软件和转录组数据构建本地数据库；（3）在NCBI数据库中搜索该基因在其他物种中的蛋白质序列，随机选取20条，然后用NCBI数据库中的ConservedDomains对这20条序列的结构域进行分析，得出它们都具有MADS-box结构域和K结构域，然后分别用这20条序列在BioEdit软件中进行本地Blast分析，记录每次相似性较高的序列编号，然后选出出现频率最高的几条序列信息；（4）从5-3序列文件夹寻找相应序列信息，构建Fasta文件，逐一分析各条序列的结构域，保留含有MADS-box结构域和K结构域的序列;（5）然后用DNASTAR软件中的Seqman软件进行序列拼接，选择未拼接在一起的序列进行下一步的分析；（6）在NCBI数据库中对这些序列进行BLASTx分析，分析其与其它物种的相似性并预测其可能所属家族，若其与牡丹中已克隆出的某一基因相似性太高则剔除；18 第2章材料与方法（7）在NCBI数据库中的ORFFound中查找每条序列的开放阅读框、编码区和非编码区，同时和其在BLASTx中的序列信息进行分析比较；（8）用Primer5.0在各序列非编码区设计特异性扩增引物，其大小为22bp，选择没有引物二聚体、发卡结构、错误引发等信息的引物。引物由上海生工合成。合成引物信息如下表（表2-4）：表2-4基因克隆所用引物Table2-4Primersusedtoclonegenes引物序列碱基数PsFUL1F5'AAAGAAGAAACTCCTGCCACAT3'22PsFUL1R5'ATTCCAAAAACACATTCAAACC3'22PsSOC12F5'TTTCTTCGGTATTCCATTTTTG3'22PsSOC12R5'GAATCGTACGTCGGAGATTATA3'22PsAGL15F5'TATTATCCCTTCTTCGTTTTGC3'22PsAGL15R5'CTTTCTTTTTTTTTTCCTTTCA3'222.2.5牡丹开花相关基因的PCR扩增克隆开花基因PsFUL1、PsSOC12、PsAGL15采用20μl的反应体系，经单一变因量试验筛选后，最终确定本试验的反应体系各组分用量如表2-5所示，Taq酶最终选用Takara的高保真酶ExTaq。经退火温度梯度扩增后最终确定退火温度为60℃，具体扩增程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，60℃退火50秒，72℃延伸1分钟，35个循环，最后72℃延伸8分钟。PCR扩增产物于4℃保存。然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，用凝胶成像仪拍照备用。19 河南科技大学硕士学位论文表2-5RT-PCR20μl扩增体系：Table2-520μLRT-PCRamplificationreactionvolumes组分体积cDNA2μl10×PCRBuffer2μlMgCl2(20mM)1.5μldNTP(10mM)1.6μl上下游引物(20μM)各0.5μlExTaq(5U/μl)0.2μlddH2Oupto20μl2.2.6PCR扩增产物琼脂糖凝胶回收（1）根据TakaraMiniBEST切胶回收试剂盒说明书，在紫外灯下切取目的片段所在位置的琼脂糖凝胶，用纸吸尽胶表面的TBE溶液，为了提高回收效率，胶块体积尽量小；（2）称胶块重量，切碎胶块于1.5ml离心管中；（3）向离心管中加入3倍胶块重量的GM溶液，即1mg胶块加3μlGM溶液；（4）不间断震荡使胶块完全溶解，此时溶液呈黄色，当溶液为其他颜色时则需加入10μl3M醋酸钠溶液使混合液变为黄色；（5）将SpinColumn管置于CollectionTube管上，将（4）步骤中的混合液转移至SpinColumn管中，室温12000rpm离心1分钟，弃滤液，为提高DNA回收率重复该步骤一次；（6）将700μl的已加入无水乙醇的BufferWB溶液加入到SpinColumn管中，将SpinColumn管安置于CollectionTube管上，室温12000rpm离心30秒，重复该步骤一次；（7）将SpinColumn管安置于新的CollectionTube管上，加入30μl60℃预热的无菌双蒸水，静置1分钟，室温12000rpm离心1分钟洗脱DNA。20 第2章材料与方法2.2.7回收产物与载体连接将回收得到的目的片段与克隆载体pMD-18T连接：连接反应体系如表2-6所示，然后用灭菌枪头吸打几次使溶液混合均匀后6000-8000rpm瞬时离心10秒左右，将连接产物于16℃连接30分钟后直接用于转化，连接产物于-20℃保存。图2-610μl连接反应体系Table2-610μLligationreactionvolumes组分体积回收DNA4μlSolutionI5μlpMD-18T1μl2.2.8转化及阳性克隆筛选：（1）LB培养基的配制：1LLB液体培养基由10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物和10gNaCl组成，完全溶解后定容至1L，每3mlLB液体培养基分装到10ml离心管中，高压灭菌后4℃保存备用。而1LLB固体培养基由10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，10gNaCl和15g的琼脂粉组成，用NaOH调溶液PH为7.0，经高压灭菌后当培养基温度在50℃左右时加入600μl氨苄青霉素溶液，混合均匀后每30ml制一个平板，其中氨苄青霉素的贮藏浓度为100mg/ml，则其工作浓度为60μg/ml。（2）打开超净工作台，水浴锅42℃，将LB固体培养基、液体培养基，连接产物和感受态细胞DH5α（于冰盒上融化）放在超净工作台上吹无菌风10分钟；（3）取1.5ml离心管加入50μl感受态细胞和10μl连接产物轻弹混匀，冰浴30分钟；（4）将大管于42℃水浴锅中水浴45秒，然后再冰浴2分钟；（5）取400μlLB液体培养基加入1.5ml离心管中，混匀后用封口膜封严，将离心管置于锥形瓶中放入37℃振荡器中震荡1小时。（6）打开培养皿，加入100μl已完成转化的混合液于平板中央，用涂布器涂布均匀；21 河南科技大学硕士学位论文（7）灼烧涂布器冷却后图下一个平板，一切完成后用封口膜将培养皿封严实；（8）将培养皿放置在37℃振荡器中静置避光培养，先正置培养1小时，再倒置培养16小时；在超净工作台中向3mlLB液体培养基的离心管中加入1.2μl氨苄青霉素即120μg氨苄青霉素（其贮藏浓度100mg/ml）混合均匀，然后打开培养皿，用灭菌的牙签粘取一个个单菌落后放入液体培养基中，在37℃振荡器中摇菌12小时；将变浑浊的菌液在4℃冰箱保存。2.2.9质粒提取操作步骤：（1）吸取1ml菌液于1.5ml离心管中，高速离心机12000rpm离心5分钟后弃上清，然后加入SolutionI100μl，剧烈震荡摇匀后静置5分钟；（2）加200μlSolutionII于离心管中，轻轻摇匀后放冰上5分钟至溶液清亮；（3）加入SolutionIII150μl，轻轻摇匀后冰浴5分钟至杂质充分沉淀；（4）高速离心机12000rpm离心5分钟，吸取上清液转移至新的离心管中后加入2倍体积的预冷无水乙醇，混合均匀后冰浴30分钟；（5）高速离心机12000rpm离心5分钟，弃上清，超净工作台吹无菌风20分钟后加50μl无菌双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用。将含有目的条带的质粒送北京英威捷基公司测序，引物是M13通用引物。2.2.10生物信息学分析根据测序结果首先利用DNAMAN软件查找相关引物序列去掉载体，然后利用NCBI的ConservedDomains在线软件进行结构域分析，BLASTx进行在线同源序列分析，用ORFFinder在线查找牡丹PsFUL1、PsSOC12、AGL15基因cDNA的开放阅读框，用ProtParam软件进行氨基酸残基数目、组成、蛋白质相对分子量、理论等电点等理化性质分析。用软件NetSurfP分析蛋白质的二级结构，用Protscale软件中的Hphob./Kyte&Doolittle进行氨基酸亲疏水性分析，使用本地软件MEGA5.0构建系统进化树等。22 第2章材料与方法2.2.11实时荧光定量PCR反应根据实时荧光定量PCR引物设计原则，设计了3对引物（表2-7）。根据文[98]献报道，选择表达量相对稳定的泛素基因作为牡丹实时荧光定量PCR中的内参基因，qRT-PCR20μl反应体系为2×SuperRealPreMixPlus10μl，引物0.3μl（20μM），2μl的模板cDNA，无菌双蒸水补足。反应程序为：95℃预变性15秒；95℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸32秒，40个循环。每个反应做三次重复。扩增反应结束后，从72℃缓慢加热（+0.5℃/Cycle）到95℃，每个-ΔΔCt温度反应0.5秒，以建立PCR产物的溶解曲线。试验数据采用2方法分析。表2-7qRT-PCR引物序列Table2-7theprimersequenceofqRT-PCR引物序列PCR产物长度qPsFUL1F5'TGCTACAAAAAGAAAGAAGAAA3'qPsFUL1R5'TCAATGACAAAATGAAAACCCT3'136bpqPsSOC12R5'TCCCCTCAACTTACCTCGTCTT3'qPsSOC12R5'TCTTCCCCCTTGCCATTTCCAA3'132bpqPsAGL15F5'TATTATCCCTTCTTCGTTTTGC3'qPsAGL15R5'TGCTTTTATTCTCGATCCTCTG3'120bpqUBQF5'ACCCCCAACCCCTTCTTCCCCATTCTCA3'qUBQR5'CCCCCGCATTTCGACGGCCTCCCATCG3'23 河南科技大学硕士学位论文2424 第3章结果与分析第3章结果与分析3.1总RNA的提取、检测与cDNA合成采用改良的CTAB法提取了‘洛阳红’牡丹不同部位的总RNA，经分光光度计测定OD260和OD280的比值均在1.8-2.0之间，可知RNA的纯度较好，经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示总RNA的28S和18S条带清晰，且28S带亮度约为18S带的两倍，这表明RNA完整性良好（图3-1）。将提取的高质量RNA用试剂盒反转录合成cDNA以备后续试验使用。1234528S18S图3-1不同组织的总RNA电泳图1、2、3、4、5分别是‘洛阳红’的花芽、叶片、花瓣、苞片、根的总RNAFig.3-1AgrosegelelectrophoresisanalysisoftotalRNAoffloralbud,blade,petal,bractandroot3.2牡丹PsFUL1基因的克隆与分析3.2.1牡丹PsFUL1基因的克隆以反转录的‘洛阳红’花芽cDNA为模板，PsFUL1F和PsFUL1R为特异性引物进行PsFUL1基因的PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测后发现在1000bp左右有一条特别亮的带（图3-2）。将这条带切胶回收后，连接到pMD18-T载体上后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，利用菌液PCR鉴定阳性克隆，将正确的阳性克隆送北京英威捷基公司测序。经测序拼接去载体后，发现所扩增条带的核苷酸序列长度为1072bp。将扩增序列进行BLAST分析，发现该片段与大多数AP1/FUL基因的相似性高，ORFFound分析发现所克隆得到的序列包含完整的开放阅读框，将此基因命名为PsFUL1。25 河南科技大学硕士学位论文M12000bp1000bp1072bp750bp500bp250bp100bp图3-2PsFUL1基因的扩增电泳图M：DL2000Marker；1：PsFUL1基因的扩增产物Fig.3-2AgrosegelelectrophoresisanalysisofPsFUL1M:DNAmarkerDL2000;1:amplifiedproductofPsFUL13.2.2PsFUL1基因的序列分析使用http://web.expasy.org/translate/在线工具将PsFUL1序列翻译成氨基酸序列，发现PsFUL1共编码353个氨基酸，使用ORFFinder分析PsFUL1cDNA序列，发现ORF编码区起始于第126bp，结束于第893bp，全长为768bp，共编码255个氨基酸（图3-3）。对PsFUL1蛋白进行结构域分析，发现PsFUL1具有MADS超家族、K-box超家族的结构域和ARG80多结构域，其中MADS超家族结构域又分为MADS-MEF2-Like结构域、MADS结构域和SRF-TF结构域（图3-4）。前两者是MADS-box基因特有的保守结构域，ARG80不但是MADS基因相关的转录因子，还能调节精氨酸的代谢，其中MADS-MEF2-Like结构域位于2-79aa之间，MADS结构域位于2-59aa之间，是由57个氨基酸组成的高度保守的结构域，K-box位于75-173aa之间，ARG80结构域位于1-131aa之间。BLASTp分析结果表明，PsFUL1与八仙花的AP1/FUL类蛋白、光皮桦的MADS1S、垂枝桦的MADS4、月季的AP1/FUL类蛋白、葡萄的FUL类蛋白具有26 第3章结果与分析较高的同源性，相似率分别达65%、66%、64%、63%、66%。这说明PsFUL1属于AP1/FUL类蛋白，具有促进花序分生组织分化，调控植物开花的作用。图3-3PsFUL1基因的ORF序列及推导的氨基酸序列Fig.3-3AnalysisoftheopenreadingframesequenceanddeducedaminoacidsequenceofPsFUL1运用http://web.expasy.org/protparam/预测PsFUL1编码的蛋白质的理化性质，推测该蛋白的分子式为C1269H2086N386O390S9，相对分子质量为29279.4，等电点为9.49。该蛋白中相对含量较多的氨基酸是Leu（11.80%）、Gln（10.60%）、Glu（8.20%），相对含量较少的氨基酸是Cys（1.20%）、Phe（1.20%）、Trp（0.80%），总的带负电荷残基Asp(D)+Glu(E)数目为29，总的27 河南科技大学硕士学位论文图3-4PsFUL1基因ORF序列的结构域Fig.3-4AnalysisoftheopenreadingframedomainofPsFUL1图3-5PsFUL1的疏水性分析Fig.3-5AnalysisofPsFUL1’shydrophobicity28 第3章结果与分析带正电荷残基Arg(R)+Lys(K)数目为38。运用预测软件http://web.expasy.org/protscale/中的Hphob./Kyte&Doolittle对PsFUL1编码的蛋白的亲疏水性进行分析，结果表明，PsFUL1大部分区域为亲水性氨基酸（共有198个亲水氨基酸），亲水区域主要集中在51-210aa之间，可达到-3.578，疏水性氨基酸有49个，可达到2.356，总和为-193.122小于零，因此该基因编码的蛋白为亲水蛋白（图3-5）。运用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/对PsFUL1蛋白质序列的二级结构进行预测：PsFUL1蛋白的二级结构由39.73%的α螺旋、24.37%的β折叠和36.03%的不规则卷曲构成（图3-6）。由此可知PsFUL1编码的蛋白包含更多的α螺旋和不规则卷曲。这些信息可以为进一步研究牡丹中PsFUL1的功能提供理论基础。图3-6PsFUL基因的二级结构预测Fig.3-6SecondarystructuralpredictionofPsFUL3.2.3PsFUL1同源性比较与系统进化分析将PsFUL1氨基酸序列提交至NCBI数据库进行在线BLAST，选择同源性较高的13个物种的15条AP1/FUL亚家族氨基酸，具体是八仙花（HydrangeamacrophyllaBAG68946.1），光皮桦（BetulaluminiferaAIX02981.1），玫瑰（RosahybridcultivarACS74808.1），葡萄（VitisviniferaAAT07448.1、AAT07447.1、AAP32475.1），可可（TheobromacacaoXP007032866.1），绒毛烟草（NicotianatomentosiformisXP009625854.1），板栗（Castaneamollissima29 河南科技大学硕士学位论文PsFUL1MGRGRVQLKRIENKISRQVTFSKRRTGLLKKAHQISVLCDVEVALIVFSTKGKLYEYSSESSMERILERYERYSYAEKQL80八仙花MGRGRVQLKRIENKISGQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTVSSMGSILERYERYSYAESQL80光皮桦MGRGRVQLKRIENKISRQVTFSKRRTGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEFSSDSSMDRILERYERYSYADRHL80玫瑰MGRGKVQLKRIENKISRQVTFSKRRTGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYATDSSMEGILERYEQYSYAERQS80葡萄FULlMGRGRVQLKRIENKISRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTDSSMERILERYERYSLSERQL80可可MGRGRVQLRQIENKISRQVTFSKRRTGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSNKGKLFEFSTDSSMERILDRYEQQSNAERQL80葡萄AP1lMGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRTGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTDSCMEKILDRYERYSYAERQL80葡萄MADS6MGRGRVQLKRIENKISRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTDSSMERILERYERYSLSERQL80绒毛烟草MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVGLIVFSTKGKLFEYSTDSCMERILERYERYSYAERQL80板栗MGRGRVQLKRIENKY.RQVTYSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSSDSSMETILERYERYSFAERQL79昆栏树MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYSTDSSMERILERYERYSYAEREL80林烟草MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRASGLLKKAHEISVLCDAEVGLIVFSTKGKLFEYSTDSCMERILERYERYSYAERQL80娑罗双木MGRGRVQLRRIENKISRQVTFSKRRTGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSNKGKLFEYSTDSSMERILERYERNAYAERQL80番茄MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVGLIVFSTKGKLFEYSTDSCMERILERYERYSYAERQL80小粒咖啡MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDAEVALIVFSTKGKLFEYATDSCMERILERYERYAYAERQL80领春木MGRGRVQLKRIENKISRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCEADVAVIVFSTKGKLFEYSTNSGMEGILERYERYYYAEQEV80ConsensusmgrgvqlienkqvtskrgllkkahisvlcvivfskgklesmilryePsFUL1GTID.PESQGSWSHEYPKLVARIEVLQRSMRHISGEELDPLSLRELQNLEQQLDTALKRVRTRKNQLMNETISEFQKKEK159八仙花VANN.SQPQGSWSLEHPKLMAKIEVLQRNIRHYVGEDLDPLSLRELQSLEQQIDTALKRIRTRKNQLMHESVSDLQKKER159光皮桦MATE.SESQGSWSLEFPKLSARIEVLERNIRNLLGEDLDPLSLRELQNMEQQLDTGLKRLRTRKNQVMHESIMELQKKEK159玫瑰MGVPASESQGNWSMEFPKLTARIEILQRKIRNYTGEDLDPLSLRELQSLEQQIDTALKRVRARKNQVMHESISEMQKKHR160葡萄FULlLSTD.PDPQGNWSMDYPKLTARIEVLQRNLRHFVGEDLDPLSLRELQNLEQQLDTALKRIRTRKNQLMHESISELQKKEK159可可VPTG.SESQGNWSLECPKLMSTIEALQRNLRHFLGEELDPLSLRDLQLLEQQIDTSLKRIRTRKNQLMHESISELQKRER159葡萄AP1lTATD.PESQGNWSLEYSKLKAKIELLQRSQRHFLGEDLDSLSLKELQNLEQQLDTALKHIRSRKNQLMYESISELQRKEK159葡萄MADS6LSTD.PDPQGNWSMDYPKLTARIEVLQRNLRHFVGEDLDPLSLRELQNLELQLDTALKRIRTRKNQLMHESISELQKKEK159绒毛烟草TTTD.HETPGSWTLEHAKLKARIEVLQRNQRHYAGEDLDSLSMKELQNLEHQVDSALKHIRSRKNQLMHESISELQKKDK159板栗VATD.SESQGGWCMEFPKLTARVEVLQRNIRNFMGEDLDPLSFRELQNLEQQIDAGLKRIRTRKNQLMHESVMELQKKEK158昆栏树VAID.AESQGSWSLEYTKLKARFEVLQRNQRHFLGEDLGSLSLRELQNFEQQLDSALKLIRSRKSQLMYESISELQRKEK159林烟草TATD.DETPGSWTLEHAKLKARLEVLQRNQRHYAGEDLDSLSMKELQNLEHQLDSALKHIRSRKNQLMHESISELQKKDK159娑罗双木LPND.SESQTNWSLEFPKLKSRIEALQKNVKHFVGEELAPLSLRELQHLEQQIDTALKRIRSRKNQLMHESISELQKKEK159番茄NATD.IITPGSWTLEHAKLKARLEVLQRNQKHYAGEELDTLSMKELQNLEHQLDSALKHIRSRKNQLMHESISELQKKDK159小粒咖啡GGAE.IESQGCWSLEHAKLKARIEVLQRNQRHYMGEDLDNLSLRELQNLEHQLDTALKHIRSRKNQLMFESIAELQKKDK159领春木VATD.PESLGNWSMEYAKLKAKVDVLQRTQRHFMGEDLDSLSLKELQHLEQQLDTAMKQIRSRKNQLMYESVVELQRKDK159ConsensuswkllgellslqeqdkrrkqmeqPsFUL1ALQEQNNLLAKKLKQND.KINADQRTQRQQQQQDHGQNSSALMLAPPQQPPAS...L...P.........VACLNIGQRL223八仙花ALQEQNNLLAKKLKDNE.KTVAE.RPQLKQ.QNLPHN......TSTFM..FPPPPQP...L.........LHSLTIGGNF216光皮桦ALQEQNNLLSKKIKENE.KAVAEHAHLE...QPSIGQNLSTFMLSLPQQPQPQPPTL...P.........LPSLTIGGTF223玫瑰TLQEQNNSLAKKLKENE.KLLQE.EPNNNQ.QP...N......PSTLVLMPPLQATSPPAL.........LSSLTIGGAF219葡萄FULlSLVEQNNALAKKVKEKE.KVEQNNRAQWEQ.QNNIGQ......NSSAY..VVPPPPL...Q.........LPSLTIGGSF217可可ALQNQNNMLAKKLKENE.KTQTE.HAQCEQ.QNLSQN......SSSFI..QPPPATI...E.........FPSLTIGGSF216葡萄AP1lAMQEQNNMLAKEIKEK.EKTVAQQTHWE...QQNHGLNTSSFLLPQQ.......................LPCLNMGGTY212葡萄MADS6SLVEQNNALAKKVKEKE.KVEQNNRAQWEQ.QNNIGQ......NSSAY..VVPPPPL...Q.........LPSLTMGGSF217绒毛烟草ALQEQNNKLSKQVKERE.KELAQQTQWEQ..QSHDHLNSSTFVLSQP.......................LSSLHLGEAY213板栗SLQEQNSVLAKKLKENE.KNIPEQAHQE...QPSLGL......LSLPQ..QPMPSTL...S.........LPSLTIGGAF214昆栏树ALQQQNNLLAEKLKEK..KALAQQAHWE...QGNQVQNPSTFLLPQS.......................LPSLNISGTY211林烟草ALQEQNNNLSKQVKERE.KELAQQTQWEQ..QSHDHLNSSSFVLTQP.......................LSSLHLGEAY213娑罗双木LLREQNDTLSKKLKEND.KTVAE.KPPQPQ.LQHVGQ......SSSSQFIQPPPLPL...PLPPRTATLPFPSLTIGGRF227番茄ALQEQNNNLSKQVKERE.KEMAQQTPWEQ..QSHDHLNSSSFVLPHP.......................FNNLHIGEAY213小粒咖啡ALQEQNNVLAKKVKDKE.KEQAQQPQWER..QNRHDLNSSSLVRSQP.......................INSLSISETY213领春木VLQEQNSMLEKKIKEME.KSIAQQRHWE...QQNQGQNSPSFLLSQT.......................LPSLTIGGTY212ConsensusqnlkklPsFUL1EGGCGVV..EDV......GHQTQR...TSHIVLPPWMLPNLNT...255八仙花QENV.SIGQENG......AQI.RPNSNP...LMPPWMLRHVNQ...248光皮桦QAGA.GD..EDA......GAQTRP...SANRLMPPWMLSHING...254玫瑰QGRG.DAMDEDAEDHQGSAQT.RPASNT...LMPPWMVRHLNK...257葡萄FULlVGRA.VE..EDG......AEA.RPSPNT...LMPPWMLRHVNE...247可可QAIE.GANKEAE......TQP.QPSTNT...VIPPWMLSHVNR...248葡萄AP1lQGEAH.............GARRNE...LDLT..LEPIYPSHLGCFT240葡萄MADS6VGRA.VE..EDG......AEA.RPSPNT...LMPPWMLRHVNE...247绒毛烟草STAGDNG..EVE......GSSRQQ...QQNT..VMPPWMLRHLNN.245板栗QERA.VD..EDA......GVQTRP...T...LMPPWMLRHVNG...242昆栏树QARGTGG..EDE......GSQPHN...RTNT..LMPPWMLRHMNE.243林烟草PTAGDNG..EVE......GSSRQQ...QQNT..VMPPWMLRHLNG.245娑罗双木QVSE.G....AE......GTS.RPS.NS...LMPAWMLRHLNG...254番茄PNAGDNG..EVE......GSSRQQ...QQNSASVMPPWMLRHLNG.247小粒咖啡HRGGDNE..AEG......TQSS.....QTNA..VMHPWMLRQMN..242领春木QARCTGG..EEE......EARTQS...RFNT..HMPPWMLRHLNP.244Consensus图3-6PsFUL1氨基酸序列与其它物种同源AP1/FUL类氨基酸比较Fig.3-6AligmentofPsFUL1withhomologousAP1/FULproteinsfromotherplants30 第3章结果与分析AAZ77749.1），昆栏树（TrochodendronaralioidesABQ85945.1），林烟草（NicotianasylvestrisNP001289508.1），娑罗双木（ShoreabeccarianaBAN89458.1），番茄（SolanumlycopersicumNP001294867.1），小粒咖啡（CoffeaArabicaAHW58040.1），领春木（EupteleapleiospermaABG49519.1）。运用DNAMAN软件将这些序列进行比对后发现：PsFUL1与不同植物的AP1/FUL亚家族氨基酸序列同源性不同，其中PsFUL1与葡萄、光皮桦、八仙花具有较高的同源性，与葡萄的AP1类蛋白（AAT07447.1）的同源性最高达到了69%，由图3-6发现，AP1/FUL亚家族具有MADS和K-box高度保守的结构域，这也确保了PsFUL1同源基因的生物学功能。为更好的了解PsFUL1基因与其它植物同源AP1/FUL基因之间的进化关系，选取了13个物种的15条同源AP1/FUL编码的氨基酸序列，利用MEGA5.0软件构建系统进化树，结果如图所示（图3-7）。结果表明光皮桦与板栗聚为一束，PsFUL与葡萄聚为一束，烟草和番茄一束，葡萄、领春木与昆栏树一束，与同源比对结果一致。图3-7PsFUL1与其他物种AP1/FUL氨基酸序列构建的系统进化树Fig.3-7PhylogenetictreeconstructedbasedonthecompleteaminoacidsequencesofAP1/FULfromdifferentspeciesbyMEGA5.031 河南科技大学硕士学位论文3.2.4PsFUL1的表达分析PsFUL1作为AP1/FUL亚家族基因，在植物开花时间、花分生组织分化、果实发育等方面具有重要作用，在已克隆出该基因的基础上，为了了解PsFUL1基因的表达模式，特别是在牡丹不同组织中的表达情况，本试验以牡丹UBQ基因为内参基因，采用相对荧光定量PCR的方法对PsFUL1基因在牡丹‘洛阳红’的根、叶、花芽、苞片和花瓣中的表达进行检测，结果表明（图3-8），PsFUL1在花芽中的表达量最高，花瓣中的表达量次之，叶片和苞片中的表达量几乎在同一水平，根中的表达量最少，花芽中的表达量约是根中表达量的17倍。20.0015.0010.00相对表达量5.000.00根叶片花芽苞片花瓣图3-8PsFUL1在不同组织中的表达分析Fig.3-8AnalysisofPsFUL1expressionindifferentorgansbyqRT-PCR3.3PsSOC12基因的克隆与分析3.3.1PsSOC12基因的克隆以反转录的‘洛阳红’花芽cDNA为模板，PsSOC12F和PsSOC12R为特异性引物进行PsSOC12基因的PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测后发现在1000bp左右有一条特别亮的带（图3-9）。将这条带切胶回收后，连接到pMD18-T载体上后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，利用菌液PCR鉴定阳性克隆，将正确的阳性克隆送北京英威捷基公司测序。经测序拼接去载体后，32 第3章结果与分析发现所扩增条带的核苷酸序列长度为957bp。将扩增序列进行BLAST分析，发现该片段与大多数SOC1基因的相似性高，ORFFound分析发现所克隆得到的序列包含完整的开放阅读框，将此基因命名为PsSOC12。M12000bp1000bp957bp750bp500bp250bp100bp图3-9PsSOC12基因的扩增电泳图M：DL2000Marker；1：PsSOC12基因的扩增产物Fig.3-9AgrosegelelectrophoresisanalysisofPsSOC12M:DNAmarkerDL2000;1:amplifiedproductofPsSOC123.3.2PsSOC12基因的序列分析使用http://web.expasy.org/translate/在线工具将PsSOC12序列翻译成氨基酸序列，发现PsSOC12共编码311个氨基酸，使用ORFFinder分析PsSOC12cDNA序列，发现ORF编码区起始于第133bp，结束于第732bp，全长为600bp，共编码199个氨基酸（图3-10）。对PsSOC12蛋白进行结构域分析，发现PsSOC12具有MADS超家族、K-box超家族的结构域和ARG80多结构域，其中MADS超家族结构域又分为MADS-MEF2-Like结构域、MADS结构域和SRF-TF结构域（图3-11）。前两者是MADS-box基因特有的保守结构域，ARG80不但是MADS基因相关的转录因子，还能调节精氨酸的代谢，其中MADS-MEF2-Like结构域位于2-69aa之间，MADS结构域位于3-60aa之间，33 河南科技大学硕士学位论文K-box位于82-169aa之间，ARG80结构域位于1-93aa之间。BLASTp分析结果表明，PsSOC12与番茄的SOC1类蛋白、矮牵牛的FBP22、葡萄的SOC1类蛋白、马铃薯的SOC1类蛋白、甜橙的SOC1类蛋白具有较高的同源性，相似率分别达56%、57%、61%、56%、60%。这说明PsSOC12是MADS-box中SOC1的同源基因，是重要的开花促进因子，也是开花途径中的重要信号整合因子，能调控花分生组织的分化。图3-10PsSOC12基因的ORF序列及推导的氨基酸序列Fig.3-10AnalysisoftheopenreadingframesequenceanddeducedaminoacidsequenceofPsSOC1234 第3章结果与分析图3-11PsSOC12ORF结构域图3-11PsSOC12基因ORF序列的结构域Fig.3-11AnalysisoftheopenreadingframedomainofPsSOC12运用http://web.expasy.org/protparam/预测PsSOC12编码的蛋白质的理化性质，推测该蛋白的分子式为C980H1625N287O300S14，相对分子质量为22677.2，等电点为8.98。该蛋白中相对含量较多的氨基酸是Glu（11.10%）、Lys（10.10%）、Leu（9.50%），相对含量较少的氨基酸是Asp、His、Phe、Tyr均为2.00%，Pro（1.00%）和Trp（0.50%）。总的带负电荷残基Asp(D)+Glu(E)数目为26，总的带正电荷残基Arg(R)+Lys(K)数目为32。运用预测软件http://web.expasy.org/protscale/中的Hphob./Kyte&Doolittle对PsSOC12编码的蛋白的亲疏水性进行分析，结果表明，PsSOC12大部分区域为亲水性氨基酸（共有142个亲水氨基酸），亲水区域主要集中在51-180aa之间，可达到-2.367，疏水性氨基酸有48个，可达到2.167，总和为-101.704小于零，因此该基因编码的蛋白为亲水蛋白（图3-12）。运用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/对PsSOC12蛋白质序列的二级结构进行预测：PsSOC12蛋白的二级结构由55.42%的α螺旋、9.98%的β折叠和34.64%的不规则卷曲构成（图3-13）。由此可知PsSOC12编码的蛋白包含更多的α螺旋和不规则卷曲。这些信息可以为进一步研究牡丹中PsSOC12的功能提供理论基础。35 河南科技大学硕士学位论文图3-12PsSOC12的疏水性分析Fig.3-12AnalysisofPsSOC12’shydrophobicity图3-13PsSOC12基因的二级结构预测Fig.3-13SecondarystructuralpredictionofPsSOC1236 第3章结果与分析3.3.3PsSOC12同源性比较与系统进化分析将PsSOC12氨基酸序列提交至NCBI数据库进行在线BLAST，选择同源性较高的13个物种的16条SOC1氨基酸序列，具体是番茄（SolanumlycopersicumNP001276829.1），矮牵牛（PetuniaxhybridAAK21253.1），葡萄（VitisviniferaXP002263450.1、NP001267909.1、XP010661478.1），马铃薯（SolanumtuberosumXP006362696.1），甜橙（CitrussinensisNP001275771.1），林烟草（NicotianasylvestrisXP009766770.1），樱桃（PrunuspseudocerasusAIU94286.1），野生草莓（FragariavescasubspvescaXP011470416.1、XP004308127.1），大桉（EucalyptusgrandisXP010061717.1），梅花（PrunusmumeXP008234315.1），可可树（TheobromacacaoXP007051978.1），芝麻（SesamumindicumXP011101156.1），胡杨（PopuluseuphraticaXP011002079.1）。运用DNAMAN软件将这些序列进行比对后发现：不同植物的SOC1氨基酸序列同源性不同，其中PsSOC12与大桉、梅花、野生草莓（XP004308127.1）、葡萄（XP002263450.1）、甜橙的SOC1类基因的同源性高，与大桉的SOC1类基因氨基酸同源性最高达到了66%，由图3-14发现，SOC1基因属于MADS-box基因家族，具有MADS和K-box高度保守的结构域，这也确保了SOC1同源基因的生物学功能。在多重对比的基础上，为更好的了解PsSOC12基因与其它植物同源SOC1基因之间的进化关系，选取上述13个物种16条SOC1类的氨基酸序列，利用MEGA5.0软件构建系统进化树，结果如图所示（图3-15）。结果表明番茄、林烟草、矮牵牛聚为一束，梅花与樱桃、野生草莓聚为一束，与植物分类学基本吻合。37 河南科技大学硕士学位论文PsSOC1.....MARGKIQMKKIENVTSRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVAVIIFSQNGRLYEFSSSGMKKTIERYNC.AKA74番茄.....MVRGKVEMKRIENSTSRQVTFSKRRNGLTKKAYELSVLCDAEVAFIIFSHKGRLYEFASSNMQKIIERYRGRARE75矮牵牛..MQEMVRGKVQMKRIENATSRQVTFSKRRNGLMKKAYELSVLCDAEVAVVIFSQRGRLYEFSSSSMQKTIDRYRECARE78葡萄SOC1l.....MVRGKIQMRRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVAVIIFSQKGRLYEFSSSNMQSAIERYREHAKQ75马铃薯.....MVRGKVEMKRIENSTSRQVTFSKRRNGLTKKAYELSVLCDAEVAFIIFSHKGRLFEFASSNMQKIIERYHARARE75甜橙.....MVRGKIQMKKIENDTSRQVTFSKRRNGMLKKAYELSVLCDAEVAVIIFSQKGRLYEFSSSEMQKTLERYYRYTEE75林烟草MKKIKMVRGKVQMKRIENLTSRQVTFSKRRNGLVKKANELSVLCDAEVALIIFSQKGRLYNFASSNMQKTIERYHERARE80樱桃.....MVRGKIEMKRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAFELSVLCDAQVSVIIFSQKGRLYEFSSSDMQDTIKRYHKHAKA75野生草莓SOC11.....MVRGKIEMKRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVAVIVFSQKGRLYEFSSSDMQKTIKRYHKHAKG75野生草莓SOC12.....MVRGKIEMKRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVAVIVFSQKGRLYEFSSSDMQKTIKRYHKHAKG75葡萄MADS.....MVRGKTQMRRIENATSRQVTFSKRRNGLFKKAFELSVLCDAEVALIIFSPRGKLYEFSSSSMQETIERYQRHTKD75大桉.....MARGKIQMKRIENATSRQATFSKRRNGLMKKAFELSVLCDAEVAVIIFSQRGRLYEFSSSNMQKTIERYHQYAKE75葡萄MADS1.....MVRGKTQMRRIENATSRQVTFSKRRNGLFKKAFELSVLCDAEVALIIFSPRGKLYEFSSSSMQETIERYQRHTKD75梅花.....MVRGKIEMKRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAFELSVLCDAQVSVIIFSQKGRLYEFSSSDMQETIKRYHKHAKA75可可树.....MVRGKTQMRRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAFELSVLCDAEVALIIFSPRGKLYEFASSSMQETIERYNRHTKD75芝麻.....MVRGKVQMKRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIIFSQKGRLFEFSSSNMQKTIGRYLEHAKD75胡杨.....MVRGKTQMRRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAFELSVLCDAEVAVIVFSPRGKLYEFGSSSVQETIERYQRHVKE75ConsensusmrgkmientsrqtfskrrngkkaelsvlcdavfsglfssryPsSOC1..VEMKN...TESEEYVEQSKHEAANMAKMIQHLQVCQW....RLLGQDLESCSMDQIHGIEAQLERSLSNIKKKKDLVF145番茄TTTVDKS...TELEHYMENLKHETANMAKKIEILEISKR....KLMGQGLGSCSMDELEDIDSQLERTLKIIRARKTQLF148矮牵牛.TLTNNS...IQAQQQIQYLKEETENMAKKIEVLEVSRR....KLTGQSLGSCSMNELQQIDSQLERSLKNIRARKSQLF150葡萄SOC1l..VETNN...PELEQYMQNLKQDAESMAKKIELLEVSQR....KLLGQGLSSCSLDEILEIDSQLEKSLKSIRARKAQIF146马铃薯TMTVDKS...TELEHYMENLKHETANMAKKIEILEVSKR....KLMGQGLGSCSMDELEDIDSQLERTLKIIRARKTQLF148甜橙..RQIDR...NGMERYMQQLKHEIANMIEKIEHIEVSQR....KLLGQDLGSRTNEELQELDDQLERSLRSIRARKAQLF146林烟草.TVVDNS...TELQQYMEHLKHETANMAKKIEILEVSKR....KLMGQGLGSCSMDELQEIDSKLERSLENIRARKAQLF152樱桃..GQTNK...IEVEEYVEQLKHESTAMAKKIENLEASQR....KLLGHGLDSCSVEELQEITGQLERSVRNIRERKAHLF146野生草莓SOC11..AQTNT...TEVEQYMQQLKHESADMAKKIEILEASQRFMTWRLLGHDLDSCSAQELNQISSQLERSIRIVRDRKGQLF150野生草莓SOC12..AQTNT...TEVEQYMQQLKHESADMAKKIEILEASQR....RLLGHDLDSCSAQELNQISSQLERSIRIVRDRKGQLF146葡萄MADS....VHTNNYKTTEHNMQQLKHEAANMAKKIELLEISKR....KLLGEGLGSCSIEELQQIEQQLERSVSSIRARKNQVF147大桉..DTGKK...ASMEQYMLHLKHEAADMSRKIELLEASKR....KFLGQGLESCSVDELQEISVQLERSLSTIRVKKDQLF146葡萄MADS1....VHTNNYKTTEHNMQHLKHEAANMAKKIELLEISKR....KLLGEGLGSCSIEELQQIEQQLERSVSSIRARKNQVF147梅花..GQTNK...IEVEEYVEQLKHESTAMAKKIENLEASQR....KLLGHGLDSCSVEELQEITGQLERSVRKIRERKAHLF146可可树....TRT...KPSEQNMQLLKTEAANMVKKIELLEVSRR....KLLGEGLGSCTLEELLQIEQQLERSVSSIRARKAQVF144芝麻..RGTSI....EVEQHMQHLKHEAAFMAKKIELLENAQR....KLLGHNIGTCSMEELQQIDNQLERSLKNIRARKLQLF145胡杨....SNTNNQ.TMELTVEQLKGEAASMIKKIELLEVSKR....KLLGECLGSCTIEELQQIEQQLERSVSTIRARKNQVF146ConsensuskmiglekfPsSOC1KEQVEQLKAKEALMLEENARLREKCGI.....Q.PL..AQHR.EAVNC.................SR.......SSVVGT192番茄KEEIESLKAKERLLLQQNASLREKCG...LRPM.LSESASAPEPIPAPPSTPPAQSKERGNCSQSTK.......SWEVET217矮牵牛EDEIERLKAKKNLLLEENARLSEKCG...QMSREPA..........LAPPDPLIQQQEKGNCSLSIK.......NSEVET210葡萄SOC1lQEQIEELKEREKQLLEENARLSQKDT...RQWQ.LS..AQPS...............EGVTYSQSSP.......SSEVET198马铃薯KDEIEHLNAKERLLLQQNASLREKCG...FMPM.LLESA....PAPAPVPVPPPQAKERGNCSQSTK.......SWEVET213甜橙NEQMGQLKEKERLLLEDNARLCIKCGQKPW..Q.QS..TQRK.......EAV..........NNCSQ....SGQSSDIET200林烟草NDEIESLKARESLLLEENKNLREKCR...LMPT.PS..........APPPPPPTQLKERGNCSKNTQ.......NLEVET211樱桃AEQMEQLRAKERLLLEENAKLSEEFGAQPRLQQ.LS..VEEK.......GAV..........SYWSQ....SSLSSEVET202野生草莓SOC11MEQIERLQAKERILLEENTKLHIACGARPWQQH.IV..QEKEV......GAATYNWMNSSQSSSSQT....ISNSDQVET217野生草莓SOC12MEQIERLQAKERILLEENTKLHIACGARPWQQH.IV..QEKEV......GAATYNWMNSSQSSSSQT....ISNSDQVET213葡萄MADSKEQIEQLKEKEKALAAENAMLCEKCGVQPYQA...P..NQEN...............ETLPSAERSQNSDVSTDLFIGLP207大桉KEQIEQLKAKEVFLIEENSRLCEK..............VELL.......FAL.SNRIKLFQVSSLFSQKK..........194葡萄MADS1KEQIEQLKEKEKALAAENAMLCEKCGVQPYQA...P..NQEN...............ETLPSAERSQNSDVSTDLFIGLP207梅花AEQMEQLRAKERLLLEENAKLSEEFGAQPRLLL.QQ..QQLS.......VEE..........KGAVSYWSLSSPSSEVET206可可树KEQIEQLKEKEKVLAAENARLCEKCGMQPWQG...S..KEQK...............ENVPCDESSPSIDVETELFIGPP204芝麻KEEIEKLQAKEKFLLEENARLSDKCG...MRGR.HA..AEKQ...............KEIGRNNQST.......RSEVVT197胡杨REQIEQLKQKEKLLTAENARLSNKCGVQPWRV...L..SREQ...............R.....ESSSISDVETELFIGLP201ConsensuslnlPsSOC1ELVIGLP.....199番茄ELFIGLPQTRCL229矮牵牛DLFIGLRS....218葡萄SOC1lELFIGLPEMRCS210马铃薯ELFIGFPQMRCL225甜橙ELFIGLPEMRAA212林烟草ELFIGLPAMRCS223樱桃ELFIGPPVTRC.213野生草莓SOC11GLFIGPPAMRCE229野生草莓SOC12GLFIGPPAMRCE225葡萄MADSEGRAKRLLLGN.218大桉............194葡萄MADS1EGRAKRLLLGN.218梅花ELFIGPPVTRC.217可可树ERRTKCFLL...213芝麻ELFIGPPTIRNA209胡杨ETRTRRLP....209Consensus图3-14PsSOC12氨基酸序列与其它物种同源SOC1氨基酸比较Fig.3-14AligmentofPsFUL1withhomologousSOC1proteinsfromotherplants38 第3章结果与分析图3-15PsSOC12与其他物种SOC1氨基酸序列构建的系统进化树Fig.3-15PhylogenetictreeconstructedbasedonthecompleteaminoacidsequencesofSOC1fromdifferentspeciesbyMEGA5.03.3.4PsSOC12的表达分析以牡丹UBQ为内参基因，采用荧光定量PCR的方法对牡丹‘洛阳红’根、叶、花芽、苞片、花瓣5个器官组织中PsSOC12表达进行检测，结果表明（图3-16）PsSOC12在花芽中的表达量最高，在根中表达量较低。20.0015.00relative10.005.00相对表达量quantityexpression0.00根root叶片花芽苞片花瓣图3-16PsSOC12在不同组织中的表达分析Fig.3-16AnalysisofPsSOC12expressionindifferentorgansbyqRT-PCR39 河南科技大学硕士学位论文3.4牡丹PsAGL15基因的克隆与分析3.4.1牡丹PsAGL15基因的克隆以反转录的‘洛阳红’花芽cDNA为模板，PsAGL15F和PsAGL15R为特异性引物进行PsAGL15基因的PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测后发现在1000bp左右有一条特别亮的带（图3-17）。将这条带切胶回收后，连接到pMD18-T载体上后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，利用菌液PCR鉴定阳性克隆，将正确的阳性克隆送北京英威捷基公司测序。经测序拼接去载体后，发现所扩增条带的核苷酸序列长度为1096bp。将扩增序列进行BLAST分析，发现该片段与大多数AGL15亚家族基因的相似性高，ORFFound分析发现所克隆得到的序列包含完整的开放阅读框，将此基因命名为PsAGL15。M12000bp1096bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3-17PsAGL15基因的扩增电泳图M：DL2000Marker；1：PsAGL15基因的扩增产物Fig.3-17AgrosegelelectrophoresisanalysisofPsAGL15M:DNAmarkerDL2000;1:amplifiedproductofPsAGL1540 第3章结果与分析3.4.2牡丹PsAGL15基因的序列分析使用http://web.expasy.org/translate/在线工具将PsAGL15序列翻译成氨基酸序列，发现PsAGL15共编码357个氨基酸，使用ORFFinder分析PsAGL15cDNA序列，发现ORF编码区起始于第75bp，结束于第815bp，全长为741bp，共编码246个氨基酸（图3-18）。对PsAGL15蛋白进行结构域分析，发现AGL15具有MADS超家族、K-box超家族的结构域和ARG80多结构域，其中MADS超家族结构域又分为MADS-MEF2-Like结构域、MADS结构域和SRF-TF结构域（图3-19）。前两者是MADS-box基因特有的保守结构域，ARG80不但是MADS基因相关的转录因子，还能调节精氨酸的代谢，其中MADS-MEF2-Like结构域位于2-72aa之间，MADS结构域位于2-60aa之间，K-box位于91-171aa之间，ARG80结构域位于1-61aa之间。BLASTp分析结果表明，PsAGL15与欧洲大叶杨的AGL15类蛋白、胡杨的AGL18、大豆的AGL18、鹰嘴豆的AGL18、荷花的AGL15具有较高的同源性，相似率分别达54%、54%、53%、51%、57%。这说明PsAGL15属于AGL15亚家族，是开花抑制因子，同时具有促进胚胎发育，延缓衰老进程的作用。运用http://web.expasy.org/protparam/预测PsAGL15编码的蛋白质的理化性质，推测该蛋白的分子式为C1221H2027N351O381S19，相对分子质量为28329.7，等电点为8.21。该蛋白中相对含量较多的氨基酸是Val（11.00%）、Tyr（11.00%）、Trp（8.50%）、Thr（7.70%），相对含量较少的氨基酸是Cys（2.00%）、Asp（2.00%）、Asn（2.00%）、Arg（0.80%）、Ala（0.40%），总的带负电荷残基Asp(D)+Glu(E)数目为35，总的带正电荷残基Arg(R)+Lys(K)数目为37。运用预测软件对PsAGL15编码的蛋白的亲疏水性进行分析，结果表明，PsAGL15大部分区域为亲水性氨基酸（共有181个亲水氨基酸），亲水区域主要集中在60-180aa之间，可达到-2.533，疏水性氨基酸有57个，可达到2.811，总和为-130.507小于零，因此该基因编码的蛋白为亲水蛋白（图3-20）。运用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/对PsAGL15蛋白质序列的二级结构进行预测：PsAGL15蛋白的二级结构由45.21%的α螺旋、9.76%的β折叠和45.12%的不规则卷曲构成。由此可知PsAGL15编码的蛋白包含更多的α螺旋和不规则卷曲（图3-21）。这些信息可以为进一步研究牡丹PsAGL15的功能提供理论基础。41 河南科技大学硕士学位论文图3-18PsAGL15基因的ORF序列及推导的氨基酸序列Fig.3-18AnalysisoftheopenreadingframesequenceanddeducedaminoacidsequenceofPsAGL15图3-19PsAGL15基因ORF序列的结构域Fig.3-19AnalysisoftheopenreadingframedomainofPsAGL1542 第3章结果与分析图3-20PsAGL15的疏水性分析Fig.3-20AnalysisofPsAGL15’shydrophobicity图3-21PsAGL15基因的二级结构预测Fig.3-21SecondarystructuralpredictionofPsAGL1543 河南科技大学硕士学位论文3.4.3PsAGL15同源性比较与系统进化分析将PsAGL15氨基酸序列提交至NCBI数据库进行在线BLAST，选择同源性较高的17个物种的18条AGL15亚家族的氨基酸序列，具体是荷花（NelumbonuciferaXP010279516.1），欧洲大叶杨（PopulustrichocarpaXP002308020.1），胡杨（PopuluseuphraticaXP011048083.1），大豆（GlycinemaxXP006575259.1），洛矶山耧斗菜（AquilegiacoeruleaAFX72882.1），芝麻（SesamumindicumXP011075339.1），鹰嘴豆（CicerarietinumXP004513865.1、XP004516227.1），苹果（MalusdomesticaXP008351603.1），白梨（PyrusxbretschneideriXP009363197.1），沙梨（PyruspyrifoliaAJW29031.1），油桐树（JatrophacurcasXP012086200.1），林烟草（NicotianasylvestrisXP009758657.1），醉蝶花（TarenayahasslerianaXP010557822.1），龙眼（DimocarpuslonganAEL16646.1），甜橙（CitrussinensisXP006492965.1），巨桉（EucalyptusgrandisXP010067793.1），葡萄（VitisviniferaXP010659213.1）。运用DNAMAN软件将这些序列进行比对后发现：不同植物的AGL15氨基酸序列同源性不同，其中PsAGL15与荷花、洛矶山耧斗菜、欧洲大叶杨、胡杨、白梨、油桐树、鹰嘴豆、林烟草的AGL15同源基因具有较高的同源性，与荷花的最高达到了58%，由图3-22发现，PsAGL15基因具有MADS-box基因家族特有的高度保守的MADS盒和K-box域，这也确保了PsAGL15同源基因的生物学功能。为更好的了解PsAGL15基因与其它植物同源AGL15之间的进化关系，选取了17个不同物种的18条AGL15同源氨基酸序列，利用MEGA5.0软件构建系统进化树，结果如图所示（图3-23）。结果表明白梨、沙梨、苹果聚为一束，大豆和鹰嘴豆聚为一束，芝麻和林烟草聚为一束，AGL15的进化基本符合植物分类学。3.4.4PsAGL15的表达分析以牡丹UBQ基因为内参，采用荧光定量PCR的方法对牡丹‘洛阳红’根、叶、花芽、苞片、花瓣5个器官组织中PsAGL15表达进行检测，结果表明（图3-23），PsAGL15在花芽中的表达量最高，在营养器官根和叶中表达量几乎在同一水平。44 第3章结果与分析图3-23PsAGL15与其他物种AGL15氨基酸序列构建的系统进化树Fig.3-23PhylogenetictreeconstructedbasedonthecompleteaminoacidsequencesofAGL15fromdifferentspeciesbyMEGA5.0图3-24PsAGL15在不同组织中的表达分析Fig.3-24AnalysisofPsAGL15expressionindifferentorgansbyqRT-PCR45 河南科技大学硕士学位论文3.5讨论植物经过长期的发育进化，形成了一套复杂而精细的基因调控网络，以确保植株能在最佳时间开花。开花时间是由一系列特定的基因在特定的时空环境下表达及相互作用所决定的。植物开花调控的分子机理是最近研究的热点之一，MADS-box基因广泛存在于真核生物中，几乎遍布整个植物界，其家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。AP1/FUL亚家族基因既属于A功能基因与分生组织决定、花发育相关，又可以促进植物开花、调控茎生叶形态及果实发育。矮牵牛中已克隆4个该亚家族成员，PFG、FBP26、FBP29和PhFL，PFG在茎、叶、苞片、花瓣中表达，而幼苗和根中表达量少，其超表达后部分转基因产生共抑制现象，使植株保持营养生长状态，但顶部偶尔会出现开花。小麦中的该亚家族3个成员，VRN1、VRN2、VRN3，VRN2在花器官中表达，另外两个在营养器官表达。SOC1基因能综合来自光周期、温度、激素以及植物生长阶段相关的多种开花信号。研究发现大豆中的SOC1同源基因GmGAL1在各个组织以及不同发育阶段具有波动性，推测其实一个多功能基因，而拟南芥中GmGAL1的过表达会是拟南芥的花期提前，说明它是开花促进因子。而AGL15亚家族基因是新进化形成的亚家族，能通过结合DNA和调控基因表达促进种子胚的发育，拟南芥中AGL15组织性表达使植株体内活性赤霉素的含量减少，导致转基因植株矮小，开花晚。本文克隆得到的PsFUL1、PsSOC12、PsAGL15基因均属于MADS-Box基因家族，具有高度保守的MADS盒和K-box结构域，以及ARG80结构域，其中PsFUL1属于AP1/FUL亚家族，PsAGL15属于AGL15亚家族，生物信息学分析表明，它们的氨基酸序列大都以亲水性为主。同源性比较与系统进化树分析表明，牡丹属于核心真双子叶植物基本符合APG分类系统，能够反映亲缘关系的远近。荧光定量表达发现三个基因在牡丹根、叶、苞片、花芽、花瓣中均有表达，它们均在花芽中的表达量最高，PsFUL1、PsSOC12均在根中的表达量最低，而PsAGL15在根和叶中的表达量几乎在同一水平且都比较低。由此可以推断，基因表达与花器官形成有关，具体机理需进一步研究。3.6小结本研究采用同源克隆的方法，从牡丹‘洛阳红’花芽中克隆得到了三个与开花相关的MADS-box基因PsFUL1、PsSOC12、PsAGL15，其中PsFUL1属于AP1/FUL亚家族，PsAGL15属于AGL15亚家族，它们都具有高度保守的MADS46 第3章结果与分析盒和K-box结构域，以及ARG80结构域，具有调控开花时间和控制花分生组织形成的作用，因此克隆开花相关基因对指导牡丹花期调控具有重要意义。通过同源性比较发现，PsFUL1与葡萄、光皮桦、八仙花具有较高的同源性，与葡萄的AP1类蛋白的同源性最高达到了69%，其中PsSOC12与大桉、梅花、野生草莓、葡萄、甜橙的SOC1类基因的同源性高，PsAGL15与荷花的同源性最高达到了58%。荧光定量表达三个基因在牡丹根、叶、苞片、花芽、花瓣中均有表达，它们均在花芽中的表达量最高，PsFUL1、PsSOC12均在根中的表达量最低，而PsAGL15在根和叶中的表达量几乎在同一水平且都比较低。47 河南科技大学硕士学位论文4848 第4章结论第4章结论本研究以蔷薇型牡丹品种‘洛阳红’为试验材料，通过电子克隆和同源克隆的方法，采用RT-PCR技术从‘洛阳红’牡丹花芽中成功分离了PsFUL1、PsSOC12、PsAGL15三个开花相关基因，并通过荧光定量法对这三个基因在牡丹不同器官中的时空表达进行了研究。主要研究结果如下：（1）根据本课题组‘洛阳红’牡丹转录组数据，通过构建本地数据库，进行同源序列的本地BLAST，从转录组数据中分离出同源性较高的几条序列信息，经过生物信息学分析后根据这些序列设计特异性引物，通过RT-PCR，从‘洛阳红’花芽中分离出了开花相关基因PsFUL1、PsSOC12和PsAGL15（2）PsFUL1基因全长1072bp，开放阅读框768bp编码255个氨基酸，属于MADS-box基因家族的AP1/FUL亚家族，具有高度保守的MADS盒和K-box结构域以及AGR80结构域，主要在花芽中表达，在根中表达量低，这说明PsFUL1调控花分生组织的形成，具有促进开花的作用。（3）PsSOC12基因全长957bp，编码199个氨基酸的开放阅读框（长600bp），属于MADS-box基因家族，是开花途径重要的信号整合因子，也是开花促进因子，具有MADS盒和K-box保守结构域以及AGR80结构域，主要在花芽中表达。（4）PsAGL15基因全长1096bp，开放阅读框741bp编码246个氨基酸，具有高度保守的MADS盒和K-box结构域以及AGR80结构域，属于AGL15亚家族，在牡丹花芽中表达量较高，在根和叶片中的表达量较低。49 河南科技大学硕士学位论文50 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缩略语词汇表缩略语词汇表英文缩写英语全称中文全称TrisTris(hytdroxymethy)aminomethane三羟甲基氨基甲烷EDTAEthylenediaminetetraacetieacid乙二胺四乙酸PVPPolybinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮CTABcetyltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基溴化铵DEPCDiethylPyrocarbonate焦碳酸二乙酯RNARibonucleicacid核糖核酸TBETris-Boracic-EDTAbufferTris-硼酸-EDTA-缓冲液mRNAmessageRNA信使RNAcDNAComplementaryDNA互补DNAbpBasepair碱基对Ampampicllin氨苄青霉素LBLuria-bertanimediumLB培养基DNaseDeoxyribonuclease脱氧核糖核酸酶dNTPDeoxyribonucleosideTriphosphate脱氧核苷三磷酸PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RT-PCRReversetranscriptionPCR反转录聚合酶链式反应qRT-PCRquantitativereal-timePCR实时荧光定量PCRORFOpenReadingFrame开放阅读框BlastBasicLocalAlignmentSearchTool基本局部比对搜索工具UBQUbiquitin泛素57 缩略语词汇表5858 附录附录附1：CTAB法提取RNA的溶液配制：（1）原液配制名称用量体积4MNaCl23.38g80ml水溶解后定容至100ml10%SDS10.00g80ml水溶解后定容至100ml1MTris-HCl12.11g80ml水溶解调PH为8(加HCl)后定容至100ml0.MEDTA18.61g80ml水溶解调PH为8(加NaOH)后定容至100ml10MLiCl21.20g40ml水溶解后定容至50ml（2）100mlCTAB缓冲液配制：CTAB缓冲液原液浓度加入原液体积终浓度CTAB粉末2g2%PVP粉末2g2%NaCl4M50ml2MTris-HCl1M10ml0.1MEDTA0.5M5ml25mM加入RNasefreedH2O定容至100ml，CTAB缓冲液配好后需高压灭菌59 附录（3）100mlSSTE缓冲液配制：SSTE缓冲液原液浓度加入原液体积终浓度NaCl4M25ml1MTris-HCl1M1ml10mMEDTA0.5M0.1ml1mMSDS10%5ml0.5%加入RNasefreedH2O定容至100ml，SSTE缓冲液配好后需高压灭菌（4）1L5×TBE缓冲液配制：试剂原浓度用量Tris粉末54gH3BO3粉末27.5glEDTA0.5M20ml用RNasefreedH2O定容至1L常温保存，使用时用0.5×TBE缓冲液60 附录附2：质粒提取溶液配制（1）100mlSolutionI配制：组分用量工作浓度1MTris-HCl2.5ml25mM0.5MEDTA2.0ml10mM葡萄糖0.99g50mMddH2Oupto100ml（2）6mlSolutionII配制：组分用量工作浓度2%SDS3ml1%0.4MNaOH3ml0.2M（3）100mlSolutionIII组分用量工作浓度醋酸钾5M醋酸5MddH2Oupto100ml61 附录附3：PsFUL1测序结果：>PsFUL1AAAGAAGAAACTCCTGCCACATATATCTATATTCATCCATGCACACCCAGCTTGAGTAAATTAGGGTTTTTCTTTCTATCATCGGGCTTTTCTTGTTGTCAAAGGGTTTTCATTTTGTCATTGAAATGGGGAGGGGAAGAGTTCAGCTGAAGCGGATCGAGAACAAGATTAGTCGGCAAGTTACCTTCTCAAAACGACGGACTGGATTATTGAAGAAAGCTCATCAAATCTCGGTGCTATGCGATGTGGAGGTTGCTTTAATTGTCTTCTCTACTAAAGGAAAACTCTATGAGTATTCCTCTGAATCCAGCATGGAAAGGATCCTGGAACGATACGAGAGGTACTCGTATGCAGAGAAACAGCTTGGAACAATTGATCCCGAATCACAGGGAAGCTGGTCTCATGAGTACCCGAAGCTAGTAGCCAGGATTGAAGTCTTGCAAAGGAGCATGAGGCACATTTCGGGAGAAGAGCTTGATCCCTTGAGTTTGAGAGAGCTTCAAAATTTGGAGCAACAACTTGATACTGCTCTTAAGCGCGTGCGAACAAGAAAGAACCAACTTATGAATGAAACCATCTCCGAGTTTCAGAAAAAGGAAAAAGCCTTGCAGGAGCAAAACAATTTGTTAGCAAAGAAGCTCAAGCAGAATGACAAGATTAATGCTGATCAACGCACACAAAGGCAGCAGCAGCAGCAAGACCATGGTCAAAACTCATCTGCATTGATGCTAGCACCACCACAACAGCCTCCTGCATCACTACCAGTTGCTTGTTTAAACATCGGGCAACGTCTTGAAGGTGGGTGTGGTGTAGTCGAAGATGTGGGACATCAAACTCAACGTACATCGCATATAGTTCTGCCTCCTTGGATGCTTCCTAATTTAAACACATAAAATATAAAGTAGAGAAACTTTGTTCAACCATTGATGAGTTTCTTGATAATGAGGAAGCTTAAGATGAAGATGAAGGGTAACCTCGTTTTCCCCATTATCCTTGTTATATTTCCCCTTGTAAAAAACCTACCACTCTCCATCAAAACTTGTTTGGTTTGGTTTGAATGTGTTTTTGGAAT62 附录附4：PsSOC12测序结果：>PsSOC12TTTCTTCGGTATTCCATTTTTGGGTTCTTCCCCGTCGTTATATATTTCTGTTGTACCTTTTTTTTTCCCCTCAACTTACCTCGTCTTTGTATAAATTTTATTGTGGTTTTATTCTGAAATTTCTCGTTGGAAATGGCAAGGGGGAAGATTCAAATGAAGAAAATTGAGAATGTGACGAGTCGGCAGGTGACCTTTTCAAAACGTCGAAATGGACTTCTGAAGAAAGCTTACGAGCTCTCTGTTCTCTGTGATGCTGAAGTCGCCGTCATCATTTTCTCCCAGAACGGAAGGCTCTATGAATTCTCAAGTTCCGGCATGAAAAAAACAATTGAACGATACAATTGTGCAAAAGCAGTAGAAATGAAAAACACAGAATCAGAAGAATATGTTGAGCAATCAAAGCACGAAGCAGCTAACATGGCAAAGATGATTCAACACCTTCAAGTTTGTCAATGGAGGCTATTGGGACAAGATTTAGAGTCATGCTCTATGGACCAAATCCATGGGATAGAAGCCCAGCTGGAGCGAAGCTTAAGCAACATCAAGAAGAAAAAGGATCTAGTGTTCAAGGAACAGGTAGAGCAACTAAAGGCAAAGGAGGCACTAATGTTAGAAGAGAATGCAAGGTTACGTGAAAAGTGCGGAATTCAGCCATTGGCTCAACACAGAGAAGCAGTAAACTGCAGCCGGAGTTCAGTGGTGGGGACTGAATTGGTCATTGGACTCCCTTGAACCGTTGCTCAAGGCAGACTTCTTGGTTATTTGATGGATATTAACCAAAGCACCGGCCTAATAATTTCAGATTTGAAAATTAATTTATTTTGGCACGCCGTCAAGTAATGCTGCATATTTCTAAGCTAGCCATAACATGGAAGTTGTTATAAGTCTTAACAATAATGCATCACAGCTTAAAATGTCCTATTTTCACACCATATTATAATCTCCGACGTACGATTC63 附录附5：PsAGL15测序结果：>PsAGL15TATTATCCCTTCTTCGTTTTGCTACAAATCTCTAATTCGTTCTGTTCTCCCCTTACTGAATTTAGAATCAGAAGATGGGTAGAGCAAGAATTCCGATTCAGAGGATCGAGAATAAAAGCAGCCGACAAGTCACCTTCTCGAAAAGGCGCAAGGGTTTGATGAACAAGGCGCATGCATTAGCAACTTTATGCGATGCACAAATTGCTATTATAGTCTTCTCTATCACCGGAAAGCTTTATGAATTCTCTAGTTCTGACATGAGTTACATTCTTTCAAGATATGGCAAGGATAGGACGCATTCAGATCTTGCTTTAGCCAAATATGTTCCAAATGAATCAGTTTATGAAGTAAATGTGATGCAAGATGAAATCACATCGCTACGAACAGCATGCAGGAGGATGATGGGCAAGGAGTTGGGGGGGTTGAGTTCCAAAGAGCTGCTACAGATACAGGAACAAATAACTGAAGCCATAATATCTGTCAAGGATAAGAAGGAGGAATTATTAAGGGAGCAGCTTAAGAATTCAGAATTACAGGAGGAAAAGATGATGTTAGAGAACAAGGCTTTGCGCAAACAGGTTGAAGAGCTTCAACAGAACTTGATGCTACAGAATGCTGAACGCTGTTCGATGGAAAGGGACATGATTTCTATAAAATCAATAACTGAGCTTCGACAGAACTTGACATTAAAGGATGCAGAACCTTGCCCAATGGAAAGAGAATGGATTTCTATAAAATCATTTACTGAGCTTCGACAGAACATGACGCTACAGAATGCAGAACCTTGTCCGATGGAAGGGGCTGGATTTCTGTAAAATCGTTATCTTACTCTGATTGCTTATCGGAGGATAGTGGAGATTCAAATATTTCCTTGCAGTTAGGGTTAGGGTTGCCATGCAGTACCCAGGAGGGTGTTGGAGGTGATGGAAGGTTCGAATCCTAATTGTACCCCCGAAAGTAAAGAAAGGGGGGTGGCATTTTTTTTTCTTATTATGTTCTCTCCTCTTTTTGGGATTAACTGGGAGGTTAGAAGATCGAAACATGTGGGGATCACTTCATTGTAAGGGGACGACTTGAAAGGAAAAAAAAAAGAAAG64 致谢致谢转眼又到了一年的毕业季，而此刻的我也成为了千万大军中的一员，我的学生生涯也即将在此划上句号，尽管舍不得离开这美好的校园，舍不得各位老师同学姐妹，但为了下次更好的相聚，在此我要向这三年来对我提供帮助的每一位道谢。本论文是在侯小改教授和郭大龙教授的悉心指导下完成的。不管是选题、试验材料准备、研究方案的实施还是现在的论文撰写，都倾注了两位导师大量的心血。这三年，导师在我的生活、学习、试验各个方面都关怀备至，也给了我很多全面发展自己、历练自己的机会，同时他们严谨的工作作风、科研态度都深深地感动和鼓励着我。在此向两位导师送上我最诚挚的谢意和最崇高的敬意。同时还要感谢这三年来对我提供帮助的其他各位老师和同学，感谢课题组的每位成员，我的师兄张曦、宋程威，搭档魏冬峰，师妹石艳艳、郭琪、张琳以及师弟位伟强对我工作的支持和帮助，还感谢陪伴我度过这三年研究生生活的每位朋友，正是你们的支持和帮助，才使我克服每个困难，按时按量完成了每件事情。感谢在百忙中对本论文进行审阅的专家教授。最后衷心的感谢我的家人，因为他们的关心、理解与支持，使我能安心的学习和科研，至顺利完成了各个试验及毕业论文。段亚宾2015年4月65 致谢6666 攻读学位期间的研究成果攻读学位期间的研究成果一、攻读硕士学位期间发表的与学位论文相关的学术论文:[1]Y.B.Duan,D.L.Guo,L.L.Guo,D.F.WeiandX.G.Hou，GeneticdiversityanalysisoftreepeonygermplasmusingiPBSmarkers，GeneticsandMolecularResearch，已录用即将见刊。[2]侯小改，魏冬峰，段亚宾，郭大龙，等.不同结实性状牡丹的IPBS分析，中国油用牡丹研究进展，中国林业出版社，2014年。二、攻读硕士学位期间发表的与学位论文相关的专利：[1]郭大龙，侯小改，段亚宾，魏冬峰，吕静霞.一种牡丹基因组DNA分子标记方法，申请号：201410055992.8。67