苹果果实酸度相关基因的筛选、克隆及表达分析

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1、山东农业大学博士学位论文苹果果实酸度相关基因的筛选、克隆及表达分析姓名：姚玉新申请学位级别：博士专业：果树学指导教师：翟衡20060515LBLufia—bertanimediumLB培养基MOPS3-(N—morphplino)propanesulfonic3-N吗啉代丙磺酸MEMalicacidenzyme苹果酸酶mRNAMessageRNA信使RNANADHReducedNicotinamideAdenine还原型辅酶IDinucleofideNaAcSodiumacetate醋酸钠NILNearisogenielines近等基

2、因系NP．40NonidetP．40润湿剂P-40PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PMSFPhenylmethylSulfonyFluoride苯甲基磺酰氟PVPPolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮QTLQuantitativetraitloci数量性状位点RNaseARibonucleaseA核糖核酸酶ArpmRevolutionsperminute转／分钟RT．PCRReversetrans

3、criptativePCR反转录PCRSDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SDS-PAGESDSpoly—acrylamidegeleleclxophoresisSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SSRSimplesequencerepeat简单序列重复TAE"Iris—HCl．EDTAbufferTris．乙酸-EDTA缓冲液TBETris—Boricacid—EDTAbufferTris一硼酸．EDTA缓冲液TETris．HCI．EDTAbufferTris．HCl-'EDTA缓冲液TEMEDN,N．N’N'-Tet

4、rarnethylethylenediamineN，N，N’，N’一四甲基乙二胺TrisTtrishydryxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷V-PpaseVacuolarH+-pyrophospbatase液泡型对·焦磷酸酶X．鲫5-Bromo-4．chloro．3．indolyl—p-D．鲥actos5-溴-4一氯一3_哼l哚一13一D，半乳糖苷ide关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，

5、均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：B期：丛．，学“勺幽戳山东农业大学博士学位论文摘要苹果(MalusdomesticaB．)是世界上最重要的鲜食和加工果品之一。苹果和以苹果浓缩汁为主的加工业成为我国加

6、入世贸组织以后最具国际市场竞争力的优势农产品之一。我国长期以鲜食苹果栽培为主，主栽品种如富士系列、元帅系列、嘎啦系列等均偏甜而少酸，导致加工产品酸度低，出口效益较低，生产上迫切需要发展适宜加工的酸度高的品种。为了研究苹果酸度调控机制，本文利用分子标记、分析代谢关键酶和cDNA．AFLP差异显示的方法对控制果实酸度的基因进行了研究。主要结果如下：1．苹果果实酸月E(低)酸性状的SSR标记分析利用苹果上开发的140对SSRgI物对东光和富士的F1代群体进行了酸、非酸性状的分子标记筛选，得到一个与果实酸性状连锁的SSR标记(CH03d12)

7、，遗传距离为8．89cM。共显性分析表明酸(胁)对非酸∞∞为完全显性。2．热硼酸法提取苹果果实RNA的改良在原热硼酸法的基础上加入一些提取辅助剂并根据辅助剂的特性优化提取步骤，改良后的方法可以有效去除蛋白和多糖，从而可以从不同发育阶段的苹果果实中高效、稳定的提取高质量的RNA，所得RNA的A：。惋。大于2．0，A2；dA：。介于1．8．2．1之间。所得RNA产量高，其中前期果实RNA产率在13．40lag／g之上，后期果实RNA产率在7．02Ixg／g之上。3．苹果果实细胞质型苹果酸脱氢酶(cyMDH)基因的分离及其特征利用不同物种的

8、同源序列设计简并引物，通过RT-PCR和RACE．PCR技术分离了富士苹果果实中的细胞质型苹果酸脱氢酶基因，命名为Mal．-cyMDH,其全长为1,246bp，GenBank注册号为DQ221207，基因组序列分析表明编