‘富士’苹果红色芽变果实金属硫蛋白基因的克隆与表达分析

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1、万方数据MolecularCloningandExpressionAnalysisofTwoMetallothioneinGenesin‘Fuji，AppleanditsRedMutant(MalusdomesticaBorkh．CV·Fuji)ThesissubmittedtoQngdaoAgriculturalUniversityInFulfi1ImentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy，一一ZhongZhaodi(DepartmentofHorticulture)Supervisor：Yu

2、anYongbingQingdao．ChinaJune，2013万方数据独创性声明0IIlUlIIIItIllUl'㈣㈣ⅧY2663591本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：钟翟盟时间：历够年彭月纱日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规

3、定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：导师签名：钟召逝雨踢时间：加B年石月阳时间：勿B年占月f扩日万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要‘富士’苹果红色芽变果实金属硫蛋白基因的克隆与表达分析摘要金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类能够结合重金属的富含半胱氨酸(Cys)低分子量蛋白质，广泛分布于生物界，目前已从多种生物中克隆到了金属

4、硫蛋白基因，很多研究表明，金属硫蛋白的表达在不同的组织和不同的生长发育时期存在着明显的基因差异，而且其在植物生长中的作用目前不是十分明确。本研究从本实验室构建的‘富士’苹果红色芽变果实的SSH文库中克隆出两个金属硫蛋白基因，利用实时荧光定量PCR技术，对这两个金属硫蛋白基因在不同部位和不同时期的表达进行了初步研究，构建了原核表达载体并诱导融合蛋白表达，为以后苹果金属硫蛋白的获得和研究奠定了基础，此外还构建了植物双元表达载体和植物亚细胞定位表达载体，以方便进一步研究苹果金属硫蛋白基因在植物生长发育过程中的作用和金属硫蛋白基因在植物细胞中的表达部位。1苹果金

5、属硫蛋白基因(MdMT2、MdMT3)的克隆本文根据从构建好的SSH文库中获得的EST,q-歹'】为模板，设计引物，利用RACEPCR技术，获得两个金属硫蛋白基因的cDNA全长，分别将其命名为MdMT2和MdMT3。^锨^仍的全长为639bp，基因内部包括一个长度为240bp可编码79个氨基酸的开放阅读框(ORF)，^织^仃；的全长为495bp，基因内部包括一个长度为201bp*-ff绑-566个氨基酸的开放阅读框(ORF)。2MdMT2、MdMT3基因编码的蛋白的生物学分析利用相关生物分析软件和程序分析基因编码的蛋白的结构特点和性质，MdMT2蛋白预测

6、的蛋白分子量为7793．8Da，等电点为4．75，分子式为C297H483N910114S20，．且MdMT2具有一个Metallothio2superfamily结构功能域，跨膜预测分析MdMT2蛋白是膜间蛋白。MdMT3预测的蛋白分子量为6929．7Da，等电点为4．78，分子式为C275‰2N820103S12，跨膜预测分析^纪^仍蛋白为膜内蛋白。3Real—timePCR分析MdMT2、MdMT3基因的表达采用实时荧光定量PCR：JL术，分别分析了MdMT2、MdMT3基因在苹果果实发育不同时期的果皮中的表达差异和在叶片、花、茎，果皮、果肉五个不

7、同器官部位中的表达差异，结果表明MdMT2在芽变富士和普通富士中的表达趋势一致，都是在成熟果皮中的相对表达量最高，但在芽变富士中的表达量明显高于普通富士。MdMT3在芽变富士和普通富士中的表达趋势也是一致的，是在成熟果实的果肉中表达量最高，而且也是芽变富万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要士的表达量明显高于普通富士。4MdMT2、MdMT3基因原核表达载体的构建和诱导表达根据目的基因和载体特点设计带有酶切位点的引物，经PCR扩增、酶切、连接和转化等操作将苹果金属硫蛋白基因和原核表达载体PET．41a)=}段连接，成功构建原核表达载体PET41a-MT2和

8、PET41a．MT3。并转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达，获