授粉后黄瓜果实膨大生长相关基因的克隆与表达分析

《授粉后黄瓜果实膨大生长相关基因的克隆与表达分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、Y937851单位代码10635学号2003016西弗．虫学博士学位论文授粉后黄瓜果实膨大生长相关基因的克隆与表达分析论文作者：孙涌栋指导教师：张兴国研究员学科专业：蔬菜学研究方向：分子生物学与分子育种提交论文日期：2006年5月10曰论文答辩日期：2006年6月日学位授予单位：西南大学中国·重庆2006年5月西南大学博士学位论文量■■量皇置量●皇皇皇■皇奠■墨—■■————————■皇鼍—■_iI—曹曼旨—薯葛啊_——■■■E量酋■对非单性结实的全雌黄瓜材料人工授粉。并对授粉后0～6d的果实早

2、期发育过程进行了观察。从授粉后第2d开始，幼果生长加快，明显伸长。在授粉后3d到授粉后6d的这段时间里，幼果进入迅速生长状态。因此我们推测，授粉后0～2d是启动果实膨大生长的关键时期。利用cDNA—AFLP技术显示开花后未经授粉0h黄瓜子房和授粉后0～3d这段时间的黄瓜幼果的基因表达差异，便可能弄清楚哪些基因启动或参与了黄瓜幼果早期发育过程和起着关键作用。2利用cDNA-AFLP技术分析授粉前后黄瓜幼果的基因表达差异取开花当天未经授粉0h子房作为授粉前的幼果样品；取授粉后6h、12h、24h、3

3、6h、48h、72h幼果，并在RNA提取时等量混合后作为授粉后的幼果样品。用上海生工的UNIQ—10柱式TRIZOL总RNA抽提试剂盒分别提取授粉前和授粉后幼果样品的总RNA，两个幼果样品总RNA的0D2。o／ODm值都在1．6～l-7之间；琼脂糖电泳结果显示，28SrRNA亮于18SrRNA。且条带清晰；用PolyATtract’mRNAIsolation：SystemⅢ(Pmomega,USA)磁珠法纯他PolyA+RNA。两个幼果样品mRNA的嘶∥O现*值都在2．2～2．5之间。从电泳图谱

4、可以看出，mRNA从300bp至2kb以上的范围呈弥散分布，表明mRNA比较完接，基本没有被#肇解。符合进一步实验的需要。采用删LV第一链cDNA合成试剂盒(Sangon。Shanghai)合成单链eDNA(sscDNA)，sscDNA主要分布在500bp以上，呈弥散分布。￡coliDNA聚合酶I和置换法合成cDNA第二链(dscDNA)。然后参照Bachem(1996)cDNAIAFLP技术和CLONTECH公司的AFLP分析系统Ⅱ试剂盒的方法进行AseI／TaqI酶切、连接头和PCR扩增。6

5、％的测序胶电泳分离PCR产物。按Promega公司的银染试剂盒说明书进行银染显示，x光胶片观察灯下数码成像和统计结果，分析样品间的cDNA-AFLP差异。PCR选扩产物经6％的溅序胶电泳分离后平均每条泳道有大于100hp的谱带30～40条，转录本差示带主要位于100～300bp之闻。64对引物组合中有54．7％的引物对扩增后呈现多态性，一般能显出l～2条cDNA差示带。开花后授粉与不授粉的黄瓜幼果组织之间存在明显的基因表达差异，表明部分在子房发育时期表达的基因在授粉后子房或幼果膨大生长期被关闭，

6、而授粉后出现了新的转录本。共获得64条仅在授粉后出现的cDNA-AFLP差示片段。3反向Northern斑点杂交分析同收授粉后幼果样品中特异显示的cDNA-AFLP凝胶带，PCR扩增、UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒纯化后点膜，分别以开花当天未经授粉0h予房和授粉后6～72h幼果两个样品的sscDNA为探针，使用地高辛(DIG)核酸标记和检测试剂盒(Roche，Germany)进行探针标记、反向Northern斑点杂交和检测。64条cDNA-AFLP著示片段中有5条片段与授粉后幼果样晶的c

7、DNA探针有较强的杂交信号，而与授粉前幼果样鼎的cDNA探针有微弱的杂交信号或无杂窆信号；9条片段与两种探针均无杂交信号；其余50条片段与两种探针均有较强的杂交摘要信号。因此认为，经斑点杂交验证确定的、在授粉后幼果组织中显示的5条差示cDNA片段可能属于授粉后黄瓜果实膨大生长相关基因。4差示片段的克隆与序列分析将经反向Northern斑点杂交验证为阳性的cDNA—AFLP差示片段用册高保真DNA聚合酶进行PCR扩增、TaqDNA聚合酶加“A’，尾后，克隆到pMDl8-T载体上。转化大肠杆菌菌株X

8、Ll-Blue感受态细胞。委托公司测序。通过互联网在基因库中搜寻同源序列，初步确认所代表的基因，对新基因在GenBank上注册。其中有3条cDNA片段(C0434606、C0434607和C0434609)在基因库中未找到相似序列，可能属于新的未知基因；1条cDNA片段(C0434608)的编码序列与Mesembryanthemumcrystallinum和豌豆的谷胱甘肽还原酶基因有很高的同源性，是否暗示授粉后的黄瓜果实早期发育需要一个高度还原的胞内环境，值得进一步探明；1条cDNA片段(C04