《维生素D受体对糖尿病肾病小鼠蛋白尿的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码10459学号或申请号201312443251密级公开硕士学位论文维生素D受体对糖尿病肾病小鼠蛋白尿的影响国家自然科学基金青年项目《维生素D受体对Wnt信号通路的调控在糖尿病肾病蛋白尿及足细胞转分化中的作用》作者姓名：卢从群导师姓名：刘章锁教授学科门类：临床医学专业名称：内科学（肾脏病学）完成时间：2016年5月 原创性声明，本人郑巧卢明：所單交的学化论义是本人巧导师的指导独立进巧研Ｕ丝化明引用的内容外，本论义不包含化何其他个人兄所取料的成巧。除义中或集体ａ经发巧或撰写过的科硏成巧。对本文的研化做出里要巧献的个人和集称明。。本声明的法伴巧化化本人巧扯体，巧Ｑ作义中明确方式从。学位论文作札声円期：Ｗ／年则Ｊ鬥＾学位论文使用授权声明１３向厲郑州大学。，本人化导师巧导Ｋ完成的论义及相关的职务作｜＂｜巧邮产权根掘郑州大学巧乂化留、使用学位论文的规定，问甚学校保留或向閨家化乂部口或机构巧艾论文的复印件和山子版，允许论文被谊阅和借閲；本人投权郑州、大学可从将本学位论义的全部或部分编入巧关数掘库进巧检索，Ｗ化巧用影印、ｉ。使川巧邻旧域巧其化扯制下段保巧论巧ｌ汇编本学位论义本人离校记发表一位论文或读学化论文立搔相关的学术论义或成果时，巧若名单位化然为郑＇州大学。。保密论义在解密后应遮守此规定学位论文化札日期：月。ＨＡＬ的知呼ｊ卢呼 AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheeffectonvitaminDreceptorinproteinuriaindiabeticnephropathymiceByCongqunLuSupervisor:ZhangsuoLiuDepartmentofNephrologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2016 摘要维生素D受体对糖尿病肾病小鼠蛋白尿的影响研究生卢从群导师刘章锁教授郑州大学第一附属医院肾内科河南郑州450052摘要背景：糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)已成为终末期肾病的主要病因[1]。蛋白尿是DN患者最突出的临床表现。其发病机制复杂，目前尚无有效的治疗方法[2]。目前国际上主要观点认为:DN是一种“足细胞病”[3，4]。维生素D受体（VDR）广泛分布于人体，包括骨骼、肾脏、皮肤、甲状旁腺、乳腺等体内多数组织、器官[5]。维生素D（VD）-VDR信号系统具有调控基因表达、钙磷代谢、细胞迁移和分化、免疫反应等多种作用[6]。有研究报道VDR在长期慢性肾脏疾病、终末期肾脏病及长期糖尿病导致的微炎症状态的患者体内有表达量减少的趋势[7，8]；利用VDRA（维生素D受体激动剂，vitaminDreceptoragonist）可部分缓解DN动物模型的蛋白尿等等[9]。但是关于VDR与糖尿病肾病蛋白尿之间的关系，相关研究较少。Wnt/β-catenin信号通路参与机体细胞的生长、增殖、分化等多个生理过程[10，11，12]。研究发现VD-VDR信号系统对Wnt/β-catenin信号通路具有调节作用[13]。对于Wnt信号通路及其关键分子GSK-3β/β-catenin，未见有关VDR在DN中对其调控的相关报道。目的：1.在糖尿病肾病模型db/db小鼠中检测肾组织中VDR的表达水平及与蛋白尿量的关系；2.在小鼠肾组织中验证VDR对Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-cateninI 摘要的调控作用；3.利用VDR激动剂帕立骨化醇观察VDR在动物模型中对高糖导致的足细胞和肾损伤的保护作用。方法：随机将5周龄db/db小鼠分为3组：db/db组，db/db-二甲基亚砜组（db/db-D组），db/db-帕立骨化醇治疗组（db/db-P组），每组各20只；db/m小鼠20只作为正常对照组（n=20）。从6周起开始收集血、尿标本，检测血糖、血肌酐、尿蛋白量，与db/m小鼠的相应数据对比。于10周时作如下药物干预：db/db-P组隔日给予帕立骨化醇0.3μg/kg腹腔注射，db/db-D组注射与db/db-P组等体积的溶剂，db/m组和db/db组不给予任何处理。分别于注射前、注射后1月、2月、3月时（即10周、14周、18周、22周）每组各处死5只，取肾组织实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Weternblot检测VDR、nephrin、podocin、GSK-3β、β-catenin、α-SMA、MMP9的表达量；并制备病理和电镜切片，观察肾组织结构的变化及足细胞的形态，免疫组化检测nephrin、β-catenin的表达；免疫荧光检测VDR、podocin、α-SMA的表达。结果：1.随周龄增加，db/db小鼠体重、血糖、尿蛋白及血肌酐明显升高（P<0.05），给予帕立骨化醇治疗后尿蛋白、血肌酐水平降低（P<0.05），而对体重、血糖无明显影响。肾组织中VDR的蛋白和mRNA表达量下调（P<0.05），Pearson相关分析发现VDR和尿蛋白呈负相关（r=-0.745，P<0.01）。2.随周龄增加，db/db小鼠肾组织中VDR的蛋白和mRNA表达量减少（P<0.05），GSK-3β、β-catenin的蛋白和mRNA表达增多（P<0.05）；给予帕立骨化醇后，VDR的蛋白和mRNA表达量上调，GSK-3β、β-catenin的蛋白和mRNA表达量减少（P<0.05），说明VDR对Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-catenin有调控作用。3.随周龄增加，db/db小鼠肾组织中nephrin、podocin的蛋白和mRNA表达量减少（P<0.05），而α-SMA、MMP9的蛋白和mRNA表达增多（P<0.05），给予帕立骨化醇激动VDR后nephrin、podocin的蛋白和mRNA表达上调II 摘要（P<0.05），α-SMA、MMP9的蛋白和mRNA表达下调（P<0.05），说明VDR对糖尿病肾病小鼠的足细胞和肾脏损伤有保护作用。结论：VDR可通过调控Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-catenin，保护糖尿病肾病小鼠损伤的足细胞和肾脏，进而减少蛋白尿。关键词：糖尿病肾病db/db小鼠VDR蛋白尿GSK-3ββ-cateninIII AbstractTheeffectonvitaminDreceptorinproteinuriaindiabeticnephropathymiceByCongqunLuSupervisor:ZhangsuoLiuDepartmentofNephrologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityAbstractbackground:Diabeticnephropathy(DN)hasbecomeamajorcauseofend-stagerenaldisease.AndproteinuriaisthemostprominentclinicalmanifestationinDNpatients.Itspathogenesisiscomplex,thereisnoeffectivetreatment.Present,themainpointofview:DNisa"podocytedisease."VitaminDreceptor(VDR)iswidelydistributedinthemostbodytissuesandorgans.includingbone,kidney,skin,parathyroid,breast,etc.IthasbeenfoundthatvitaminD(VD)-VDRsignalsystemhasavarietyofrolesregulatinggeneexpression,calciumandphosphorusmetabolism,cellmigrationanddifferentiation,immuneresponse.Currently,TherearesomeaspectsoftheresearchonVDRinkidneydisease:theexpressionofVDRinpatientswithchronickidneydisease,end-stagekidneydiseaseandthemicro-inflammatorystatecausedbychronicdiabeteshasatendencytoreduce;VDRA(vitaminDreceptoragonistsagents,vitaminDreceptoragonist)canbepartiallyalleviatedproteinuriainDNanimalmodels,andsoon.ButresearchontherelationshipbetweenVDRandproteinuriaindiabeticnephropathyislittle.Wnt/β-cateninsignalingpathwayinvolvedinthebody'sgrowth,proliferation,differentiationandotherphysiologicalprocesses.VD-VDRsignalingsystemhasaregulatoryroleontheWntsignalingpathwayGSK-3β/β-catenin.ButthereisnoreportsonVDRregulatingWntsignalingpathwayanditskeymoleculeGSK-3β/β-cateninintheDN.IV Abstractpurpose:1.ObservechangeoftheVDRexpressionlevelinrenaltissueandassociatedwithproteinuriaindiabeticnephropathymodeldb/dbmice2.VerifythattheregulationofVDRonGSK-3β/β-cateninwhicharetheWntsignalingpathwaymoleculesinmousekidneytissue;3.UseVDRagoniststoobservetheprotectiveeffectonVDRinpodocytesandrenalinjurywhichcausedbyhighglucoseinanimalmodels.method:5weeksolddb/dbmicewererandomlydividedintothreegroups:db/dbgroup(n=20),db/db-DMSOgroup(db/db-Dgroup,n=20),db/db-paricalcitoltreatmentgroup(db/db-Pgroup,n=20),20db/mmiceasnormalcontrolgroup.From6weekswecollectedblood,urinespecimensofdb/dbmicetomeasurebloodglucose,serumcreatinine,urineproteincomparedwiththecorrespondingdataofdb/mmice.Forthefoliowingdruginterventionfrom10weeks:db/db-Pgroupadministeredeveryotherdayparicalcitol0.3μg/kgintraperitonealinjection,db/db-Dgroupwasinjectedwiththedb/db-Pgroup,anequalvolumeofsolvent,db/mgroupanddb/dbgroupwasnotgivenanytreatment.Respectively,beforeinjection,afterinjectionof1month,2months,3months(10weeks,14weeks,18weeks,22weeks)weresacrificed5mice.WedetectedtheexpressionofVDR,nephrin,podocin,GSK-3β,β-catenin,α-SMAandMMP9intherenaltissuebyFluorescencequantitativereal-timePCR(qRT-PCR)andWeternblot.Preparationofpathologyandelectronmicroscopywereperformedtoobservechangesinrenaltissuestructureandmorphologyofpodocytes.Theexpressionofnephrin,β-cateninwasdetectedbyimmunohistochemical,TheexpressionofVDR,podocin,α-SMAwasdetectedbyimmunofluorescence.result:1.Withthedevelopmentoftime,db/dbmicebodyweight,bloodglucose,serumcreatinineandurineproteinweresignificantlyincreased(P<0.05).Aftergivenparicalcitoltreatment,urinaryproteinandserumcreatininelevelsdecreased(PV Abstract<0.05),whilenosignificanteffectonbodyweight,bloodsugar.TheexpressionofVDRindb/dbmicerenaltissuereducedwhileurineproteingraduallyincreased（P<0.05）.PearsoncorrelationanalysisshowedtherewasacertaindegreeofnegativecorrelationbetweenVDRandurineprotein（r=-0.745，P<0.01）.2.Withthedevelopmentoftime,theexpressionofVDRindb/dbmicerenaltissuereducedwhiletheexpressionofGSK-3β/β-cateninincreased（P<0.05）.Afteradministeringparicalcitol,theexpressionofVDRincreasedwhiletheexpressionofGSK-3β/β-catenindecreased（P<0.05）.ThissuggestedthatVDRcouldregulatoryWntsignalingpathwaymolecules.3.Withthedevelopmentoftime,theexpressionofVDR,nephrin,podocinindb/dbmicerenaltissuedecreasedwhiletheexpressionofα-SMA,MMP9increased(P<0.05).Afteradministeringparicalcitol,urinaryproteindecreased（P<0.05）,theexpressionofVDRnephrin,podocinupregulatedwhiletheexpressionofα-SMA,MMP9downregulated（P<0.05）,indicatingthatVDRcanprotectpodocyteandkidneydamageindiabeticnephropathymice.Conclusion:VDRcanprotectkidneyandpodocytedamagecausedbyhighglucosebyregulatingWntsignalingpathwaymolecules,therebyreducingproteinuria.Keywords:diabeticnephropathydb/dbmiceVDRproteinuriaGSK-3ββ-cateninVI 目录目录论文部分摘要...................................................................................................................IABSTRACT.......................................................................................................IV中英文对照缩略词.........................................................................................VIII引言..................................................................................................................1材料和方法..........................................................................................................3实验结果............................................................................................................17讨论................................................................................................................32结论................................................................................................................36参考文献............................................................................................................37综述部分综述................................................................................................................42糖尿病肾病........................................................................................................42参考文献............................................................................................................52附录部分个人简历及在校期间发表的学术论文............................................................57致谢................................................................................................................58VII 中英文对照缩略词中英文对照缩略词英文缩写英文全称中文译名DNdiabeticnephropathy糖尿病肾病DMdiabetesmellitus糖尿病DKDdiabetickidIleydisease糖尿病肾脏疾病ESRDend-stagerenaldisease终末肾脏病GBMGlomerularbasementmembrane肾小球基底膜GSK-3βglycogensynthasekinase3β糖原合成酶激酶3βMMP9matrixmetalloproteinase9基质金属蛋白酶9VDRVitaminDreceptor维生素D受体LRPLDLreceptorrelatedprotein低密度脂蛋白受体相关蛋白qRT-PCRReal-timequantitativePCR实时荧光定量PCRDMSOdimethylsulfoxide二甲基亚枫TCF/LEFT-cellfactor/lymphoidenhancerfactor核转录活性因子淋巴样增强因子α-SMAα-smoothmuscleactinα-平滑肌肌动蛋白PKCProteinkinaseC蛋白激酶CVDRAVitaminDreceptoragonist维生素D受体激动剂CD2APCD2associatedproteinCD2相关蛋白EMTepithelial—mesenchymaltransition上皮-间充质细胞转分化TGF-βltransforminggrowthfactor-β转化成长因子-βVIII 引言维生素D受体对糖尿病肾病小鼠蛋白尿的影响研究生卢从群导师刘章锁教授郑州大学第一附属医院肾内科河南郑州450052引言糖尿病(DM)的发病率正在全球范围内迅速增加，预计到2025年会影响到3亿人，大约有1/3的糖尿病患者将发展为糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）[1]。蛋白尿是DN患者最突出的临床表现。尽管有各种干预措施，但是DN患者，75％为1型（T1D），20％为2型（T2D），将发展为终末期肾病（ESRD）[2]。因此,对DN的早期发病机制进行探索，及早对DN的蛋白尿情况进行干预，并予以综合有效的治疗,对于改善DN患者预后,提高其生活质量具有重大意义。蛋白尿是糖尿病肾脏病（DKD）早期即出现的临床表现，也是最常见的临床表现之一，尿蛋白量的大小与疾病的严重程度及病情进展密切相关。虽然DN的确切病因尚未研究清楚，目前国际上主要观点认为：DN是一种“足细胞病”[3]。足细胞为被覆于肾小球基底膜上的高度分化的细胞，是构成肾小球滤过屏障的关键。其结构和功能的改变在DKD蛋白尿发生发展过程中起到了关键作用[4]。糖尿病肾病病理变化主要表现为肾小球（肥大、增生、基底膜增厚、硬化），系膜增生、细胞外基质沉积等。随着研究深入，人们发现糖尿病肾病早期足细胞已经发生形态结构和功能的改变，提示足细胞损伤(形态结构、功能的改变)[14，15]是糖尿病蛋白尿发生与进展的中心靶点。受损足细胞的足突出现融合、脱落等，滤过膜完整性破坏，导致蛋白尿发生[16]。已有研究显示，足细胞在转换生长因子-β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)作用下可发生上皮-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，表现为足细胞标志物如P-cadherin、nephrin、podocin等表达减少或消失，而间充质细胞标志物，如α-SMA、MMP-9、fibronectin等表达增多[17，18，19，20]。此外，高糖环境下，小鼠肾小管上1 引言皮细胞也可发生转分化，进而引起肾脏纤维化[21]。因此，DN蛋白尿的发生、发展与足细胞屏障功能损伤密不可分。维生素D受体（VDR）是核受体超家族的一员，广泛分布于人体多种组织、细胞，比如肝细胞、胰岛细胞、肾小管上皮细胞及肾小球足细胞等[6]。现已发现，维生素D（VD）-VDR信号系统具有调控基因表达、钙磷代谢、细胞迁移和分[6，7]化、免疫反应等多种作用，并且这些作用依赖于VDR的表达水平和活性。此外，在不同组织细胞中的VDR，作用也有所不同。鉴于VDR复杂的调控机制，对VDR的作用机制及VDR激动剂的相关研究一直在不同的领域进行不断的探索。目前已有一些关于VDR在肾脏病方面的研究：和野生型小鼠相比，VDR基因被敲除的糖尿病小鼠更容易出现严重的蛋白尿以及肾小球硬化，还可以观察到足细胞的丢失[22]；激活维生素D受体或是维生素D类似物能有效减少糖尿病肾病患者的蛋白尿[23]；VDR在长期慢性肾脏疾病、终末期肾脏病及长期糖尿病导致的微炎症状态的患者体内有表达量减少的趋势[7，8，24]；利用VDRA（维生素D受体激动剂，vitaminDreceptoragonist）可部分缓解DN动物模型的蛋白尿[9]，等等。可见维生素D受体与肾脏相关疾病的关系甚为密切。但是关于VDR与糖尿病肾病蛋白尿及足细胞损伤之间的关系，相关研究甚少。[10，Wnt/β-catenin信号通路参与机体细胞的生长、增殖、分化等多个生理过程11，12]。研究发现，VD-VDR可改变癌细胞中Wnt信号通路关键分子--糖原合成酶激酶-3β和β-catenin的活性，达到阻止癌细胞与其生长微环境的相互作用。在乳腺癌的研究和结肠癌细胞发现VDR，β-catenin是相互关联的[25，26，27]。当VDR被激活时，它会与β-catenin竞争结合TCF-4，从而抑制结肠癌中β-catenin的活性[28，29]。在单侧输尿管梗阻小鼠模型中，VDR和β-catenin是与肾纤维化的程度有关，并参与了上皮细胞转分化（EMT）[30]。说明VD-VDR对Wnt信号通路GSK-3β/β-catenin具有调节作用。既往观点认为:VD-VDR系统是通过抑制RAS信号系统实现对肾脏保护和降蛋白尿作用[31]。但是对于Wnt信号通路及其关键分子GSK-3β/β-catenin，未见有关VDR在DN中对其调控的相关报道。综上所述，本研究拟利用DN动物模型db/db小鼠检测肾组织中VDR的表达水平及与蛋白尿量的关系；利用VDR激动剂帕立骨化醇验证小鼠肾组织中VDR对Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-catenin的调控作用；并观察VDR在动物模型中对高糖导致的足细胞和肾损伤的保护作用。2 材料和方法材料和方法1实验动物遗传背景为C57BLKs/J的5周龄的雄性db/db小鼠（平均体重20-25g）和同周龄同背景的db/m小鼠（平均体重18-20g)，购于南京模氏中心，在河南省实验动物中心分笼饲养，每笼5只。饲养环境SPF级，温度21-24℃，IVC-II型独立送风隔离笼，标准颗粒饲料喂养，不限制饮水，12h交替照明，每隔一日更换垫料。垫料、饲料、饮用水及其它鼠接触的物品均经消毒处理。2主要试剂试剂名称公司名称帕立骨化醇粉剂上海阿拉丁有限公司预染蛋白marker上海天能科技有限公司小鼠抗小鼠GAPDH单克隆抗体中杉金桥小鼠抗小鼠VDR多克隆抗体Santa公司小鼠抗小鼠β-catenin多克隆抗体Abcam公司小鼠抗小鼠α-SMA大鼠单克隆抗体Abcam公司小鼠抗小鼠GSK-3β单克隆抗体Abcam公司兔抗小鼠nephrin多克隆抗体Abcam公司兔抗小鼠podocin多克隆抗体Abcam公司兔抗小鼠MMP9多克隆抗体BBILifeSciencesHRP标记的小鼠抗兔、小鼠抗小鼠二抗北京鼎国昌盛生物技术公司免疫组化试剂盒中杉金桥AlexaFluor488山羊抗兔二抗GeneCopoeiaAlexaFluor594山羊抗小鼠二抗GeneCopoeia牛血清白蛋白(BSA)北京鼎国昌盛生物技术公司RIPA蛋白质裂解液北京鼎国昌盛生物技术公司3 材料和方法5×LoadingBuffer北京鼎国昌盛生物技术公司Trizol试剂美国ambion公司荧光淬灭封片剂武汉博士德生物工程公司反转录试剂盒、PCR试剂盒TOYOBOPVDF膜北京康为世纪公司四甲基乙二胺（TEMED）北京康为世纪公司过硫酸铵（AP）北京康为世纪公司脱脂奶粉北京康为世纪公司ECL发光试剂盒上海天能科技有限公司二甲苯安徽安特生物化学有限公司二甲基亚砜（DMSO）北京鼎国昌盛生物技术公司甲醇安徽安特生物化学有限公司中性树胶白石音试剂公司Tween-20天津市精细化工研究所DEPC水北京鼎国昌盛生物技术公司PAS染液试剂盒南京建成科技有限公司3主要仪器及设备仪器和设备名称公司名称全自动生化分析仪郑大一附院肾病实验室提供超低温冰箱日本SANYO公司数显恒压恒流电泳仪天能公司垂直电泳槽，转膜电泳槽天能公司荧光定量PCR仪Genecompanylimited光学倒置显微镜Leica公司荧光显微镜ZEISS公司RNA浓度测定仪法玛西亚公司高压灭菌器日本HIRAYAMA公司液氮生物容器北京恒奥生物科技有限公司血糖仪三诺生物传感股份有限公司4 材料和方法干式恒温器其林贝尔仪器组织脱水机Leica公司冰冻切片机Leica公司台式高速离心机德国Eppendorf眼科剪及眼科镊天津医疗器械有限公司凝胶成像分析系统天能公司4主要试剂配制4.1磷酸盐缓冲液(PBS)分别取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠1.44g混合，加入约900mL双蒸水混匀，然后定容至1L。4.210％过硫酸铵(10％AP)取1.0g过硫酸铵溶于双蒸水后定容至10mL，2mlEP管分装后﹣20℃保存，用前取出1支置于4℃冰箱。4.3电泳液1×RunningBuffer电子秤称取甘氨酸14.4g、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)3.03g和十二烷基硫酸钠(SDS)1.00g，加入900ml双蒸水后用搅拌棒混匀，定容至1000mL，室温保存备用。4.4转膜液1×TransferBuffer取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)3.03g及甘氨酸14.4g，溶于800ml双蒸水中，然后加入200ml甲醇，混匀后置于4℃冰箱保存备用。4.510×TBST和1×TBST10×TBST：取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)12.1g、氯化钠（NaCl）40.0g，5 材料和方法溶于400ml双蒸水，加入2.5mlTween-20,调PH约7.6，继续加双蒸水定容到500mL混匀，4℃保存。1×TBST：取100ml的10×TBST溶液与900ml双蒸水混匀，即为1×TBST。4.6WesternBlotting封闭液-5％的脱脂牛奶取2.5g脱脂奶粉，用TBST溶液稀释定容至50mL，置于4℃冰箱保存备用。4.710%SDS称取SDS粉末1.0g，溶于10ml双蒸水中，室温保存。4.8柠檬酸钠抗原修复液取柠檬酸三纳3g，柠檬酸0.4g，溶于800ml双蒸水，NaOH调整PH至6.0，然后定容至1000ml。4.91%的盐酸酒精取浓盐酸1ml，加入75%酒精99ml即成。4.105%水合氯醛溶液称取水合氯醛颗粒2.5g，用生理盐水溶解定容至10ml，避光保存。4.11帕立骨化醇溶液1mg帕立骨化醇溶于5ml二甲基亚砜中，用0.45μm滤纸一次性小滤器过滤后装入10ml无菌管中常温避光保存。每次使用前在无菌操作室取1μl原液溶于5ml无菌生理盐水中使其终浓度为0.96×10-11mol/L。6 材料和方法5实验方法5.1动物的分组和取样5.1.1动物分组同窝出生的5周龄小鼠经检疫及适应性饲养1周。随机编号将db/db小鼠分为3组：令1～20号为db/db组，21～40号为db/db-二甲基亚砜组（db/db-D组），41～60号为db/db-帕立骨化醇治疗组（db/db-P组）,db/m小鼠20只作为正常对照组。从6周龄起定期（每隔三周）测定各组小鼠体重和尾尖血糖，用代谢笼收集24h尿样。于10周龄时分别作如下药物干预：db/db-P组隔日给予帕立骨化醇0.3μg/kg腹腔注射，db/m组和db/db组不给予任何处理，db/db-D组注射与db/db-P组等量的二甲基亚砜。分别于注射前、注射1月、2月、3月时处死实验组和相应对照组小鼠各5只。5.1.2尿标本的留取各组小鼠在处死前1天于代谢笼中单独词养，加少量防腐剂甲苯于收集瓶，收集24h尿液，记录尿量，2000rpm，离心10min，去沉渣计量后留取上清分装在1.5ml的Eppendorf(EP)管内，-20℃冰箱保存，留测24小时尿蛋白。5.1.3血标本的留取尾静脉采血测血糖。每组分别于6周龄(用药前）、10周龄(用药0周)、14周龄(用药4周)、18周龄(用药8周)、22周龄(用药12周)时随机选取5只开胸心脏采血：采用5%水合氯醛按照0.1ml/10g腹腔注射麻醉小鼠，称量体重后将其仰卧位固定于塑料板上，沿其正中线剪开腹腔至胸腔，暴露心脏，用1ml注射器取血约1ml缓慢注入干净的采血管中，于37℃静置1小时并置于4℃过夜（为析出更多血清），取出后于离心机中1000×g，离心20min，取上层血清置于-20℃保存，用于检测血清学指标。5.1.4肾组织的留取迅速分离出肾脏，剔除肾包膜，沿冠状面剖开肾脏，生理盐水冲洗留取肾组织。将肾组织分三部分：一部分肾脏组织分装后置于液氮中保存，24小时后放入-80℃冰箱长期保存，用于提取RNA和蛋白、免疫荧光检测；一部分肾脏，置于20%中性福尔马林中以固定组织，石蜡包埋切片（约2μm），用于HE染色、PAS染色和免疫组化检测；另一部分肾脏皮质切成芝麻样大小10%甲醛中固定，用于电镜检测.7 材料和方法5.2血尿等指标检测5.2.1小鼠血糖检测小鼠采用尾静脉取血测血糖，每只小鼠连测3日，取3次均值为该次最终血糖值。5.2.2尿总蛋白测定尿样送至郑大一附院肾病实验室，用全自动分析仪测得尿蛋白浓度，乘于24小时尿量即得24小时尿蛋白总量。5.2.3体重测定应用电子称先测培养皿的重量，然后将小鼠放入培养皿中测总重量，再减去培养皿重量即为小鼠体重。5.2.4生化指标检测全自动生化分析仪测定血肌酐。5.3qRT-PCR检测肾组织VDR、nephrin、podocin、GSK-3β、β-catenin、α-SMA及MMP9的mRNA表达5.3.1Trizol法提取肾组织中总RNA(1)取绿豆大小的肾组织放入已经用液氮预冷的干净研钵中，加入1mlTrizol，用研磨棒快速研磨肾组织至肉眼看不见碎块，使其充分混合。(2)混合液转移到2ml无酶EP管中，室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。(3)向(2)中加入200μl氯仿（按1mlTrizol：200μl氯仿），盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。(4)混合物放入低温离心机4℃12000rpm离心20min，可见分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相转移到一个新的无RNase的离心管中。(5)在水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置30min。8 材料和方法(6)4℃12000rpm离心20min，在管侧和管底可见白色块状RNA沉淀。(7)小心倾倒上清液，按照1mlTrizol加入1ml75%乙醇的比例，加入75%乙醇（用无RNase的水配制）洗涤沉淀。可重复洗涤。(8)4℃12000rpm离心5min，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。(9)室温放置2-3min，晾干。加入30-100μlDEPC水，充分溶解RNA，-80℃保存。注意沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。操作中需要的镊子、研钵等提前一天放入DEPC水中浸泡，以去除RNA酶。5.3.2紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度1、取4ul总RNA混溶于96ulDEPC水中。2、将混匀液置于波长为260nm和280nm紫外分光光度计下，读取相应的OD值及OD260/OD280的比值。较好的RNA样品纯度OD260/OD280比值应为1.6~2.0。低于1.6考虑样品存在蛋白质污染，高于2.0考虑异硫氰酸胍等污染。3、然后按公式浓度(ug/ul)=OD260值×0.04×稀释倍数计算所测样品RNA浓度。5.3.3RNA逆转录成cDNA按照TOYOBO公司反转录试剂盒ReverTraAce®qPCRRTMasterMix操作说明进行反转录。1）RNA的变性取出的RNA放于65℃干浴锅中5min，然后迅速放置冰上冷却变性。2）反应液的配制在RNasefree的离心管中配制如下混合液RNAtemplate1pg-1μg5×RTMasterMix2μlRNasefreeddH2OTotal10μl用移液器轻轻吹打混匀。9 材料和方法3）逆转录反应上述反应液在电热恒温水槽内按以下温度进行逆转录反应：37℃15min50℃5min98℃5min4℃holdcDNA产物可在-20℃储存或立即用于qPCR反应。5.3.4实时荧光定量PCR扩增及条件按照TOYOBO公司荧光定量PCR反应试剂盒SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix操作说明进行目的基因的扩增。1）反应液的配制AceQTMqPCR蒸馏水6.4μlSYBRGreenRealtimePCRMasterMix10μl引物1.6μl模板DNA2μlTotalvolume20μl2）引物序列引物名称序列VDR上游:5'TCCTTCCTCTGCTGGTAT3'下游：5'CTCCTTGGTTAGTGTGGTAG3'nephrin上游：5'ACTGGAGGAATGTAGGTAATG3'下游：5'TGTGTTCTTGCTTCTGTGA3'podocin上游：5'AGAAGAGGAGAAGGAGTT3'下游：5'TTGGAGTTGAATGGTGTT3'GSK-3β上游：5'CCACCATCACCATTAAGAGTT3'下游：5'CGTAATCCTTCAATCCACCTT3'β-catenin上游：5'ATGGAGGAGATAGTAGAA3'下游：5'AATGGAATGGTATTGAGT3'α-SMA上游：5'AACTGTGAATGTCCTGTG3'下游：5'CATAGGTAACGAGTCAGAG3'MMP9上游：5'ACACGACATCTTCCAGTA3'下游：5'CACCTTGTTCACCTCATT3'GAPDH上游：5'AGTGGCAAAGTGGAGATT3'下游：5'GTGGAGTCATACTGGAACA3'10 材料和方法3）qPCR的循环条件步骤循环（个）温度时间预变性：195℃5min循环反应：45变性95℃30sec退火60℃30sec延伸72℃60sec融解曲线：195℃15sec60℃60sec95℃15sec反应结束后确认扩增曲线及溶解曲线，读取相应指标的CT值，按以下公式计算ΔΔCT：(CtA2-CtB2)-(CtA1-CtB1)。其中A代表目的基因Ct值，B代表内参基因Ct值，1和2代表不同的处理组。每组设3个复孔，重复三次实验，并计算平均值。计算出的结果按处理组目的基因是对照组目的基因的2-ΔΔCT倍来表示。5.4WesternBlotting检测肾组织VDR、nephrin、podocin、GSK-3β、β-catenin、α-SMA及MMP9的蛋白表达5.4.1蛋白提取取绿豆大小的肾组织放入预冷的研钵器，然后置于冰上，加入1ml蛋白提取液（每1mlRIPA裂解液中加入100nM的PMS、磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂各15µL、10µL、10µL）。使用研磨棒充分研磨组织，冰上放置20min。4℃12000rpm离心20min，收集上清液于干净的EP管中，取5×LoadingBuffer约250μl，5-10μl10%SDS加入上清液并吹打混匀，置于干浴锅中99℃，5min，取出后立即冰上冷却5min，观察有无沉淀。若有沉淀用枪头蘸取少量DTT粉末加入，再置于干浴锅中99℃，5min后冰上冷却。提好的蛋白样品可直接用于做WesternBlotting或放-80℃保存。5.4.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)（1）准备实验用品：干净的玻璃板，制胶架，烧杯，梳子，量筒等。11 材料和方法（2）灌制SDS-PAGE凝胶：将两个玻璃板对齐后垂直卡入制胶架内，加入1ml双蒸水，观察有无漏水，检验其密封性，若无漏水则倒出双蒸水，晾干玻璃板后开始配置凝胶，若漏水则重新组合玻璃板并再次验证有无漏水。根据要检测的目的蛋白分子量的大小配制10%分离胶和5%浓缩胶：组分5%浓缩胶（4mL）10%分离胶（10mL）双蒸水2.284.1730%Acr-Bis（29：1）0.683.33浓缩胶缓冲液（4×）1-分离胶缓冲液（4×）-2.510%APS0.040.1TEMED0.0040.004合计410将不同体积的30%Acr-Bis（29:1）、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯中混合，再加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌混匀，避免产生气泡。在两层玻璃板之间灌入分离胶溶液（凝胶液加至玻璃板的2/3），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2ml的无水乙醇封闭液面，使凝胶表面保持平整。水平静置30-60min，待分离胶和乙醇之间出现一个清晰的界面后，表示凝胶已聚合。然后倒掉上层无水乙醇并尽量吸干玻璃片之间的液体，加入提前配制好的浓缩胶至前玻璃板的顶端，加液应平缓均匀，防止气泡产生。注满后随即插入大小规格合适的梳子。插梳子时应注意用力均匀，防止浓缩胶溢出过多在梳子与胶体之间产生缺损。静置约30min待浓缩胶凝固后小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。（3）电泳将玻璃板从制胶架上取出放入电泳槽内，保持小玻璃板在内，大玻璃板在外；电泳槽的另一边放入一块替代玻璃板的塑料板，以保持电泳槽的密闭。然后加入1×RunningBuffer。取出待测蛋白样品恢复室温后置于干浴锅中99℃，5min使蛋白变性用于上样。上样时保持各个孔上样量基本一致，体积不足的需用1×LoadingBuffer补齐以保持蛋白条带平行。先80V恒压电泳，当溴酚蓝指示剂越过浓缩胶底层时，调整电压为120V恒压，在溴酚蓝指示剂到达分离胶底层时终止电泳。（4）转膜剪取大小合适的PVDF膜并浸入甲醇中5min左右，电泳结束后取出玻璃板，放入装有提前配置预冷的1×TransferBuffer的容器中，在转膜液中打开双层玻璃板。根据Marker条带的指示以及目的蛋白大小切胶。注意动作轻柔防止胶体破碎。将转膜夹，海绵，滤纸，PVDF膜均泡在转膜液中，按照12 材料和方法转膜夹黑面，海绵，2-3层厚滤纸，凝胶，PVDF膜，2-3层厚滤纸，海绵，转膜夹白面的顺序组合转膜夹，凝胶与PVDF膜之间不能有气泡。将夹子封口端向上装入电泳槽内，夹子的黑面对应电泳槽的黑面。在冰盒中放入冰块并将转膜槽置于冰上。根据目的蛋白的分子量大小设置直流电流350mA，转膜的时间约60-90min。（5）封闭迅速取出PVDF膜，放入5%脱脂牛奶中，置于摇床上，室温下封闭60-120min。（6）一抗孵育PVDF膜1×TBST洗3次，每次5min，用吸水纸吸走残留液体。将膜浸入1×TBST稀释过的抗体中，保证蛋白面充分接触抗体，置于4℃冰箱中过夜。（7）二抗孵育取出PVDF膜用1×TBST溶液摇床上漂洗3次，每次5min，用吸水纸吸走残留液体。将膜浸入1×TBST稀释过的二抗中，保证蛋白面充分接触抗体，室温孵育2h。（8）洗膜PVDF膜1×TBST洗3次，每次5min。（9）显色及拍照分析显色液现配现用，按照显色剂A:显色剂B=1:1的比例配置显色液，膜的蛋白面朝上完全浸入显色液中，用凝胶成像分析系统进行拍照。用ImageJ软件行灰度分析。5.5肾组织PAS(糖原)染色(1)烘烤：切片置于60℃烤片机中2h；(2)石蜡切片脱蜡、梯度入水：切片按照“二甲苯(I)10min→二甲苯(II)10min→95%、70%、30%无水乙醇各2min→蒸馏水2min”的顺序透明脱蜡；(3)1%过碘酸水溶液覆盖玻片样本上，平放于染色架上，室温避光孵育12min；(4)蒸馏水洗涤5min，2遍；(5)Schiff试剂滴于玻片样本上，室温孵育15min；(6)流水冲洗1min后自然晾干；(7)苏木素浸染4min；(8)1%盐酸酒精分化1s，流水冲洗2min；(9)酒精梯度脱水，二甲苯透明，按照步骤2的顺序反过来进行；13 材料和方法(10)晾干切片，中性树胶封片；光学显微镜下观察肾组织的形态结构，PAS阳性为红色，细胞核为蓝色。5.6免疫组化检测肾脏组织中nephrin、β-catenin的蛋白表达5.6.1免疫组化步骤（1）石蜡切片：肾脏组织石蜡包埋，切成3μm厚度薄组织，贴于防脱载玻片上，60℃恒温箱烤片2h，4℃冰箱内保存。用前再烤片30min。（2）脱蜡、水化：标本按照“二甲苯I溶液15min→二甲苯II溶液l5min→无水乙醇I5min→无水乙醇II5min→95%酒精5min→80%酒精5min→70%酒精5min”的顺序脱蜡、水化；（3）PBS洗涤3次，5min/次，去除组织周围水分，同时保持组织湿润；（4）H2O2去氧化：滴加3%的去离子H2O2覆盖样本，室温孵育20min；（5）PBS洗涤3次，5min/次；（6）微波抗原修复：将标本浸入枸橼酸钠缓冲液(PH6.0)中，微波炉中先“高火”加热3min，再“中低火”继续加热15min，待其室温自然冷却后PBS洗涤3次，5min/次；（7）血清封闭：标本上滴加30μl山羊血清，室温孵育15min，然后轻甩走多余液体，无需PBS洗涤，直接滴加一抗；（8）一抗孵育：向待测标本上分别滴加30μl兔抗小鼠nephrin多克隆抗体(1:200)，小鼠抗小鼠β-catenin多克隆抗体(1:100)，注意保持组织湿润避免干片。在空白对照组标本上滴加PBS缓冲液以代替一抗。将玻片放入湿盒内4℃冰箱过夜孵育。（9）复温：玻片从冰箱内取出后室温复温30min,PBS洗涤3次，5min/次，去除组织周围水分，同时保持组织湿润；（10）二抗孵育：滴加30μlPV-9000试剂A（生物素化二抗工作液）于标本上，室温孵育20min，PBS洗涤3次，5min/次。然后用吸水纸带走组织上残余液体，注意不要擦到组织，滴加30μlPV-9000试剂B（辣根酶标记链霉卵白素工作液），室温孵育20min，PBS缓冲液洗3次，5min/次。必要时可滴加30μlPV-9000试剂C（反应增强液），室温孵育10min，PBS缓冲液洗3次，每次5min；14 材料和方法（11）DAB显色：DAB工作液：1滴DAB浓缩液加入1mlDAB底物液（现配现用避光），向标本上滴加DAB工作液，显微镜下观察显色情况控制反应时间，自来水冲洗终止反应，自来水连续冲洗15min。（12）苏木素复染：滴加苏木素染色4min，迅速放入1%盐酸酒精分化1-2S，自来水连续冲洗15min。（13）梯度酒精脱水、二甲苯透明：标本按照“70%酒精5min→80%酒精5min→95%酒精5min→无水乙醇II5min→无水乙醇I5min→二甲苯II溶液l5min→二甲苯I溶液15min”的顺序脱水、透明；（14）封片：用中性树胶封片，覆以盖玻片，尽量避免气泡，常温保存；（15）结果分析：IPP软件分析，每片组织标本随机选取10个视野，观察肾组织阳性染色的面积取其平均值进行分析。5.7免疫荧光检测肾组织中VDR、podocin、α-SMA表达5.7.1免疫荧光步骤（1）冰冻切片：肾组织OCT包埋，切成3μm厚度薄组织，贴于防脱载玻片上，-20℃保存；（2）复温：从-20℃冰箱取出后4度复温20min，再室温复温15min；（3）固定：放入预冷-20℃的丙酮中浸泡固定10min，烘箱干燥20min；PBS洗5min×3次；吸干组织周围的水份，使载片干燥。（4）封闭：用含有0.05%TitonX-100（5μltritonx100:10ml的PBS）的10%正常山羊血清室温封闭切片1h；（5）一抗孵育：加入PBS稀释的一抗约150μl(1:100)，4℃孵育过夜；（6）PBS洗5min×3次；（7）二抗孵育：加入PBS稀释好的荧光二抗(1:500)，37℃避光孵育1h；（8）PBS洗5min×3次；（9）DAPI染色：滴加0.5%DAPI室温染色10min（DAPI:PBS=1:10000）；PBS洗5min×3次；（10）封片：晾干玻片，滴加抗荧光衰减封片剂，盖上盖玻片，透明指甲油封住盖玻片的边沿，4℃避光保存。15 材料和方法5.8电镜标本制备(1)取材：(此操作需1分钟之内在冰上完成)先用固定液冲洗组织2-3遍，用刀片成“拉锯式”将组织切下并修小成lmm×lmm×2mm大小长条形，然后用针尖将组织块挑至盛有冷的固定液的小瓶中。(2)固定：戊二醛-锇酸双重固定法2.5％戊二醛(磷酸缓冲液配制，pH7.2-7.4)4℃,固定2-4小时，0.1M磷酸缓冲液清洗，30分钟/次×2次，1％锇酸4℃固定2小时。(3)脱水：4℃冰箱中，按50％乙醇20mim→70％乙醇20mim→90％乙醇20mim→90％乙醇90％丙酮(1:1)20mim→90％丙酮20mim的顺序进行脱水。再于室温中100％丙酮20min/次，3次。(4)浸透和包埋：丙酮：环氧树脂按1:1的比例放入40℃烤箱内1小时→纯包埋剂(不加DMP-30)放入40℃烤箱内2小时→包埋剂(加DMP-30)放入40℃烤箱内2小时→环氧树脂包埋。(5)半薄切片定位、超薄切片、载网(200孔铜网)和支持膜、铅染色。(6)观察、拍片组织超薄切片由郑州大学第一附属医院电镜室专业技术人员进行操作。电镜标本由交由郑州大学第一附属医院电镜室完成。6统计学方法运用SPSS17.0软件进行统计学分析,所有数据均用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，多个变量间两两比较采用Bonferroni检验，非参数检验应用于方差不齐的数据，取α=0.05。VDR与尿蛋白关系用Pearson相关分析，取α=0.01。16 实验结果实验结果1各组小鼠的一般状况及血生化指标的比较1.1一般状况实验组小鼠（db/db小鼠、db/db-D小鼠、db/db-P小鼠）随时间发展逐渐出现多饮、多尿、多食症状，体重增加，毛色晦暗并逐渐出现脱毛现象，活动迟缓，抓持反射减退，体型向心性肥胖，脱毛，垫料潮湿有异味。确定DN模型构建成功。db/m小鼠体型适中，精神良好，反应灵敏，毛色黑亮光泽，活动、抓持反射、饮食、饮水及尿量正常，垫料干燥。1.2体重在整个实验过程中db/db小鼠、db/db-D小鼠、db/db-P小鼠体重随时间明显增加，且从6周起上述各组小鼠体重明显高于同期正常对照的db/m小鼠(P<0.01)。（见表1.2）表1.2不同时间点各组小鼠体重的比较（g）n6周10周14周18周22周db/m520.0±1.8622.56±1.5925.03±1.1224.84±0.8825.09±2.12db/db534.74±2.90*46.33±3.72*54.19±4.15*61.66±2.83*64.71±3.06*db/db-D534.25±1.86*46.27±2.83*54.88±4.68*62.52±2.97*64.69±3.37*db/db-P534.85±2.10*47.04±3.22*54.07±4.52*52.72±2.73*64.33±4.24*F119.43182.25141.59280.71288.76P0.000.000.000.000.00注：*与同周龄正常对照组db/m小鼠相比，P<0.01。n代表样本量。1.3血糖在整个实验期间，与非糖尿病db/m小鼠相比，db/db小鼠始终维持严重的高血糖，实验组小鼠（db/db小鼠、db/db-D小鼠、db/db-P小鼠）随周龄增加血糖逐渐升高，自10周龄起血糖均高于16.7mmol/L，各个时间点实验组小鼠血糖较db/m小鼠血糖差异均有统计学意义(P<0.05)。（见表1.3）17 实验结果表1.3不同时间点各组小鼠血糖的比较（mmol/L）n6周10周14周18周22周db/m56.53±1.566.17±1.196.24±1.597.72±1.727.06±1.27db/db516.04±6.06*17.58±2.45*18.10±3.48*24.78±5.10*25.7±5.09*db/db-D515.32±5.70*18.38±4.46*18.92±4.22*24.88±2.54*25.8±4.59*db/db-P516.44±4.81*18.80±3.2*18.64±4.24*24.10±6.19*26.42±4.43*P0.000.0040.0110.0130.012注：*与同周龄正常对照组db/m小鼠相比，P<0.05。n代表样本量。1.424h尿蛋白db/db-P小鼠10周时24h尿蛋白较同时期正常对照db/m小鼠明显升高（P<0.05），但从10周时给予帕立骨化醇治疗后，db/db-P小鼠14周、18周、22周时24h尿蛋白较同周期db/db小鼠和db/db-D小鼠24h尿蛋白减少且有统计学差异(P<0.05)，但db/db小鼠和db/db-D小鼠24h尿蛋白随周龄增加明显增加(P<0.05)。（见表1.4）表1.4不同时间点各组小鼠24h尿蛋白的比较（mg/L）n6周10周14周18周22周db/m51.42±0.672.23±0.052.70±0.142.59±0.062.26±0.35db/db56.79±1.30*11.06±3.84*17.17±8.57*20.61±1.13*29.44±2.31*db/db-D55.56±2.969.91±3.31*16.97±8.66*22.82±8.32*28.44±4.20*db/db-P56.61±4.4211.95±3.29*13.99±2.92*Δ＃10.91±3.80*Δ＃9.41±2.39*Δ＃P0.0220.0120.0120.010.01注：*与同周龄正常对照组db/m小鼠相比，P<0.05,Δ与同周龄db/db小鼠相比，P<0.05,＃与同周龄db/db-D小鼠相比，P<0.05。n代表样本量。1.5血肌酐db/db-P小鼠10周时血肌酐较同时期正常对照db/m小鼠明显升高（P<0.05），但从10周时给予帕立骨化醇治疗后，db/db-P小鼠14周、18周、22周时血肌酐较同周期db/db小鼠和db/db-D小鼠血肌酐减少且有统计学差异(P<0.05)，但db/db小鼠和db/db-D小鼠血肌酐随周龄增加逐渐增加(P<0.05)。（见表1.5）18 实验结果表1.5不同时间点各组小鼠血肌酐的比较（μmol/L）n10周14周18周22周db/m526.42±3.7925.64±4.8328.16±3.7727.35±3.84db/db540.33±1.89*47.44±2.08*50.83±2.00*54.2±3.06*db/db-D540.37±2.58*47.80±1.42*50.89±1.77*54.51±3.50*db/db-P541.07±2.36*42.78±1.56*Δ＃36.64±2.45*Δ＃34.84±2.04*Δ＃F31.74567.8991.9493.25P0.000.000.000.00注：*与同周龄正常对照组db/m小鼠相比，P<0.05,Δ与同周龄db/db小鼠相比，P<0.05,＃与同周龄db/db-D小鼠相比，P<0.05。n代表样本量。各组小鼠的一般状况及血生化指标的比较结果说明：db/db小鼠自10周龄起已进入糖尿病肾病蛋白尿阶段，帕立骨化醇可以减少db/db小鼠蛋白尿及血肌酐，而对体重和血糖无明显影响。2糖尿病模型小鼠肾组织中VDR的表达变化与尿蛋白量的关系2.1不同周龄及不同处理组小鼠肾组织中VDR的蛋白和mRNA的表达水平随着周龄的增加，不同周龄的db/db小鼠肾组织内VDR蛋白和mRNA较db/m小鼠表达显著减少（P<0.05）（见图1A、1B、1C）；给予帕立骨化醇后db/db-P组VDR表达上调（P<0.05）（见图1D、1E、1F）。19 实验结果ADBECF注：B、C：与db/m小鼠相比，＊P<0.05；与10wdb/db小鼠相比，＃P<0.05；与14wdb/db小鼠相比，ΔP<0.05；与18wdb/db小鼠相比，πP<0.05。E、F：与db/m小鼠相比，＊P<0.05；与db/db小鼠和db/db-D小鼠相比，＃P<0.05。图1不同周龄和不同处理组小鼠肾组织VDR表达量的比较（注：A、B：不同周龄小鼠肾组织VDRWesternBlotting结果和分析；C：不同周龄小鼠肾组织VDRqRT-PCR分析结果；D、E：22周龄时不同处理组小鼠肾组织VDRWesternBlotting结果和分析，F：22周龄时不同处理组小鼠肾组织VDRqRT-PCR分析结果）2.2不同周龄小鼠肾组织中VDR表达水平与尿蛋白量的关系对VDR和尿蛋白量进行相关分析发现VDR表达水平与尿蛋白量呈负相关，相关系数r=-0.745（P<0.01）（见图2）20 实验结果图2小鼠肾组织VDR表达与尿蛋白量的关系2.3免疫荧光检测肾脏组织中VDR的表达结果免疫荧光结果显示:随病情发展，db/db小鼠、db/db-D小鼠肾组织中VDR表达量较db/m小鼠减少，而db/db-P小鼠肾组织中VDR表达量较db/db小鼠、db/db-D小鼠增多。（见图3）图3VDR免疫荧光结果（400×）21 实验结果3VDR对Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-catenin的调控作用3.1不同周龄小鼠肾组织中GSK-3β、β-catenin的蛋白和mRNA的表达水平随着周龄的增加，不同周龄db/db小鼠肾组织内GSK-3β、β-catenin蛋白和mRNA较db/m小鼠增多（P<0.05），不同周龄db/db小鼠间各因子表达量也有统计学差异（P<0.05）。（见图4A、4B、4C）注：B、C：与db/m小鼠相比，＊P<0.05；与10wdb/db小鼠相比，＃P<0.05；与14wdb/db小鼠相比，ΔP<0.05；与18wdb/db小鼠相比，πP<0.05。E、F：与db/m小鼠相比，＊P<0.05；与db/db小鼠和db/db-D小鼠相比，＃P<0.05。图4：不同周龄和不同处理组小鼠肾组织GSK-3β、β-catenin表达量的比较（注：A、B：不同周龄小鼠肾组织GSK-3β、β-cateninWesternBlotting结果和分析；C：不同周龄小鼠肾组织GSK-3β.β-cateninqRT-PCR分析结果；D、E：22周龄时不同处理组小鼠肾组织GSK-3β、β-cateninWesternBlotting结果和分析，F：22周龄时不同处理组小鼠肾组织GSK-3β、β-cateninqRT-PCR分析结果）22 实验结果3.2不同处理组小鼠肾组织中GSK-3β、β-catenin的蛋白和mRNA的表达水平给予帕立骨化醇后db/db-P小鼠肾组织GSK-3β、β-catenin蛋白和mRNA表达量较db/db小鼠、db/db-D小鼠减少，且db/db-P小鼠、db/db小鼠、db/db-D小鼠肾组织上述因子的表达均与db/m小鼠有统计学差异（P<0.05）。（见图4D、4E、4F）3.3免疫组化检测肾脏组织中β-catenin的表达结果免疫组化结果显示:随病情发展，db/db小鼠、db/db-D小鼠肾组织中β-catenin表达量较db/m小鼠增多，而db/db-P小鼠肾组织中β-catenin表达量较db/db小鼠、db/db-D小鼠减少（P<0.05）。（见图5：阳性结果为棕黄色部分）23 实验结果注：与db/m小鼠相比，＊P<0.05；与db/db小鼠、db/db-D小鼠相比，＃P<0.05.图5免疫组化检测肾组织β-catenin表达情况（100×）上述结果显示：糖尿病肾病小鼠肾组织中VDR表达下调，GSK-3β、β-catenin表达上调，帕立骨化醇干预后VDR表达上调，GSK-3β、β-catenin表达下调，说明VDR参与Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-catenin的调控。4VDR对小鼠足细胞和肾损伤的保护作用4.1不同周龄小鼠肾组织中nephrin、podocin、α-SMA、MMP9的蛋白和mRNA的表达水平随着周龄的增加，不同周龄db/db小鼠肾组织内nephrin、podocin蛋白和mRNA较db/m小鼠表达显著减少（P<0.05）（见图6A、6B、6C），而α-SMA、MMP9蛋白和mRNA较db/m小鼠增多（P<0.05）（见图6A、6D、6E），不同周龄db/db小鼠间各因子表达量也有统计学差异（P<0.05）。24 实验结果注：与db/m小鼠相比，＊P<0.05；与10wdb/db小鼠相比，＃P<0.05；与14wdb/db小鼠相比，ΔP<0.05；与18wdb/db小鼠相比，πP<0.05。图6不同周龄小鼠肾组织nephrin、podocin、α-SMA、MMP9表达量的比较（A：不同周龄小鼠肾组织nephrin、podocin、α-SMA、MMP9WesternBlotting结果；B：不同周龄小鼠肾组织nephrin、podocinWesternBlotting分析结果C：不同周龄小鼠肾组织nephrin、podocinqRT-PCR分析结果；D：不同周龄小鼠肾组织α-SMA、MMP9WesternBlotting结果和分析；E：不同周龄小鼠肾组织α-SMA、MMP9qRT-PCR分析结果）4.222周龄时不同处理组小鼠肾组织中nephrin、podocin、α-SMA、MMP9的蛋白和mRNA的表达水平25 实验结果22周龄db/db-P小鼠肾组织nephrin、podocin的蛋白和mRNA表达量较db/db小鼠、db/db-D小鼠增多（见图7A、7B、7C），而α-SMA、MMP9的蛋白和mRNA表达量较db/db小鼠、db/db-D小鼠减少（见图7A、7D、7E），且db/db-P小鼠、db/db小鼠、db/db-D小鼠肾组织上述因子的表达均与db/m小鼠有统计学差异（P<0.05）。注：与db/m小鼠相比，＊P<0.05；与db/db小鼠和db/db-D小鼠相比，＃P<0.05。图7：不同处理组小鼠肾组织nephrin、podocin、α-SMA、MMP9表达量的比较（A：不同处理组小鼠肾组织nephrin、podocin、α-SMA、MMP9WesternBlotting结果；B：不同处理组小鼠肾组织nephrin、podocinWesternBlotting分析结果C：不同处理组小鼠肾组织nephrin、podocinqRT-PCR分析结果；D：不同处理组小鼠肾组织α-SMA、MMP9WesternBlotting结果和分析；E：不同处理组小鼠肾组织α-SMA、MMP9qRT-PCR分析结果）26 实验结果4.3免疫组化检测肾脏组织中nephrin的表达结果免疫组化结果显示:随病情发展，db/db小鼠、db/db-D小鼠肾组织中nephrin表达量较db/m小鼠减少，而db/db-P小鼠肾组织中nephrin表达量较db/db小鼠、db/db-D小鼠增多。（见图8）注：与db/m相比，＊P<0.05；与db/db、db/db-D相比，＃P<0.05.图8免疫组化检测肾组织nephrin表达情况（400×）27 实验结果4.4免疫荧光检测肾脏组织中podocin、α-SMA的表达结果免疫荧光结果显示:随病情发展，db/db小鼠、db/db-D小鼠肾组织中podocin表达量较db/m小鼠减少，而α-SMA表达上调；给予帕立骨化醇后db/db-P小鼠肾组织中podocin表达量较db/db小鼠、db/db-D小鼠增多，α-SMA表达下调。（见图9、图10）图9免疫荧光检测肾组织podocin表达情况（400×）28 实验结果图10免疫荧光检测肾组织α-SMA表达情况（400×）5肾组织形态结构变化5.1PAS染色结果PAS染色显示db/m小鼠肾组织结构正常，而db/db小鼠肾组织未见明显改变。（见图11）29 实验结果图11各组小鼠PAS染色结果（400×）5.2电镜结果透射电镜结果显示:22周龄时db/db小鼠、db/db-D小鼠肾小球基底膜不规则增厚（白色箭头所指），无电子致密物沉积，可见足突融合（黑色箭头所指）；db/db-P小鼠肾组织病变较db/db小鼠改善。db/m小鼠肾组织电镜下肾小球基底膜均质光滑无增厚，足突未见融合（见图12）30 实验结果图1222周龄小鼠肾组织电镜结果（20000×）上述结果显示：糖尿病肾病小鼠肾组织中nephrin、podocin表达下调，α-SMA、MMP9表达上调，帕立骨化醇干预后nephrin、podocin表达上调，α-SMA、MMP9表达下调；电镜结果显示糖尿病肾病小鼠肾小球基底膜增厚，足突融合，而db/db-P小鼠肾组织病变较db/db小鼠改善；说明VDR对高糖导致的足细胞和肾脏损害有保护作用。31 讨论讨论1糖尿病模型小鼠的选择与建立糖尿病动物模型主要包括诱发性模型、自发性模型、转基因动物模型。其中db/db小鼠是自发性模型中的一种，具有较高的科研价值[32-33]。db/db小鼠是一种早期糖尿病肾病的模型。由于db基因编码的来普汀受体G到T位点突变导致形成缺损性受体。这种缺失导致小鼠出现多食、肥胖、高胰岛素血症、胰岛素耐受等症状，并逐渐发展为肾病，适用于长期研究[34]。C57BLKS/J品系、C57BL/6J品系和FVB/NJ品系可以验证LepRdb/db突变[35]。因此本研究采用C57BLKS/J品系雄性db/db小鼠建立糖尿病肾病模型。本研究显示，db/db小鼠血糖自第6周开始较db/m小鼠升高，且出现多饮、多尿，体重明显增加，说明糖尿病模型建立成功。有研究证实，db/db小鼠自5-6周出现自发血糖升高，8-10周开始出现蛋白尿及肾功能损害[36]。我们实验也发现，db/db小鼠从10周龄时尿蛋白量和血肌酐明显增高，随着病情的进展，db/db小鼠蛋白尿明显增多。这与以往的研究结果基本一致。2肾组织中VDR的表达变化与尿蛋白量的关系在许多肾小球疾病的早期病程中，最早体现肾脏病理学发生改变及肾小球滤功能损伤的是蛋白尿的出现。它不仅是一项能够体现疾病进展和肾损伤预后的替代指标，也是肾脏纤维化的一个重要致病介质[37-38]。DN的病程进展大体分为初始的足细胞损伤、蛋白尿的出现乃肾脏纤维化。VDR广泛存在于人体各个组织细胞中，包括骨骼、肾脏、皮肤、甲状旁腺、乳腺等体内多数组织、器官[39]。维生素D是VDR配体。VDR与配体相结合形成激素-受体复合物，再与细胞核的维生素D反应元件相结合，激活或抑制含有维生素D反应元件的基因，从而发挥激活目的基因转录的作用[39-40]。有研究发现2型DN患者外周血单核细胞上VDR较健康人明显减少，且体外细胞实验也有类似报道，在予以活性维生素D干预以后，VDR的表达上调[41-42]。有发现VDR基32 讨论因敲除的糖尿病小鼠出现蛋白尿、肾小球硬化以及足细胞的丢失的情况很常见[43]。这都提示我们VDR在DN患者和小鼠体内表达减少，且参与蛋白尿的发生。研究发现转染过表达VDR基因的糖尿病小鼠其蛋白尿水平明显低于野生型糖尿病鼠[44]。一些临床研究已经证明1,25（OH）2D3类似物具有减少蛋白尿的治疗效果，用帕立骨化醇治疗的CKD患者，经过23周蛋白尿（使用半定量试纸法测定）下降，且该作用独立于肾小球滤过率，血压力或血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂[45]。deZeeuwD发现DN患者给予2μg/day的帕立骨化醇来抑制RAS可安全降下残留蛋白尿[46]。我们研究显示肾组织广泛表达VDR，在db/db小鼠体内VDR表达随病情进展逐渐减少。与既往研究相符合。虽然有很多研究已发现VDR与肾脏疾病相关，但关于VDR与尿蛋白的关系的研究不多。本研究检测了VDR和尿蛋白的关系，我们发现VDR与尿蛋白量呈负相关。提示VDR的表达水平与蛋白尿相关。3VDR对Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-catenin的调控作用最初发现VDR在维持钙稳态和骨骼健康方面有重要作用。最新研究认为VDR也有其他效应：预防糖尿病肾病，高血压和动脉粥样硬化，抑制RAS系统，增殖的调节和分化，减少蛋白尿，抗炎和抗纤维化状态等[47]。目前一些学者对其机制也进行了初步的探讨，包括可能与抑制RAS系统、NF-KB活性以及TGF-β/Smad信号转导等有关[48.49.50]。虽然最近几年维生素D的肾脏保护作用已得到了很好的研究，但根本保护机制仍然不清楚。经典的Wnt/β-catenin信号通路活化能够诱导足细胞的功能受损[51]。调控这一信号通路中相关因子的表达，能显著影响足细胞损伤及蛋白尿的进展及严重程度。最近的一项研究表明，帕立骨化醇可以通过抑制Wnt/β-catenin信号传导，在减少蛋白尿和肾纤维化方面起关键作用[52]。有研究证实，帕立骨化醇可以抑制ADR（阿霉素肾病）小鼠肾组织内Wnt/β-catenin通路的活性和表达量[53]。Wnt信号通路可调节慢性肾纤维化时肾小球细胞增殖和调亡：而肾小球硬化过程中存在Wnt信号通路的活化[54]。我们数据显示：随着病情的加重，db/db小鼠肾组织VDR减少、GSK-3β、β-catenin增多；帕立骨化醇处理后VDR增多，而GSK-3β、β-catenin则减少。此外我们前期研究也发现在高糖诱导的小鼠足细胞中VDR减少、足细胞发生EMT、屏障33 讨论功能受损，且免疫荧光显示VDR和β-catenin存在共定位现象[55]。在GSK-3β抑制剂处理的db/db小鼠肾组织中，VDR表达增多[56]。提示VDR可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥其保护作用。我们的研究与既往的研究一致。此外，也有研究指出VDR的缺失会导致高肾素血症以及RAS的激活[57]。活性维生素D及类似物可通过直接抑制肾素的产出，阻断RAS的活性，从而发挥肾脏保护作用[58]。提示我们VDR不仅可以通过调控RAS系统来保护肾脏，还可以通过调控Wnt/β-catenin发挥其保护作用。4VDR及VDR激动剂对小鼠足细胞和肾损伤的保护作用DKD早期蛋白尿和后期肾小球损伤发生的主要因素是足细胞损伤。足细胞特异性标记蛋白nephrin和podocin的表达异常常常提示足细胞损伤。nephrin可通过Akt途径使靶蛋白磷酸化，减轻足细胞损伤[59]。podocin通过CD-2AP连接于nephrin形成nephrin-CD2AP-podocin复合体插入细胞膜，对nephnin信号传导有增强作用，其表达紊乱可诱导蛋白尿[60]。WangY[61]等中将人的维生素D受体(hVDR)转基因转入糖尿病肾病的DBA/2Jdx鼠足细胞2.5kb的podocin启动子处，发现转基因组蛋白尿较野生型糖尿病小鼠蛋白尿明显降低。在给予低剂量的VDRA及其类似物治疗后，转基因组小鼠蛋白尿明显降低，足细胞损伤减少。与野生型小鼠相比较，VDR敲除的小鼠则表达nephrin减少、FN增多，伴随着肾素、血管紧张素的增加。而VDR激动剂能抑制系膜细胞FN的增加、增加足细胞nephrin表达，显著减轻糖尿病小鼠肾脏损害[62]。有研究用STZ诱导的DN大鼠模型发现足细胞nephrin和podocin蛋白表达均明显下降。活性维生素D治疗后能显著改善足细胞的病理变化，降低蛋白尿[63]。最新研究表明，活性维生素D能调控Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病鼠足细胞nephrin的表达，对nephrin有保护作用[64]。这些结果表明VDR及VDRA能抑制足细胞损伤、抗蛋白尿，延缓肾脏疾病的进展。本研究结果显示，帕立骨化醇可以减少小鼠血肌酐；db/db小鼠足细胞标记蛋白nephrin、podocin较db/m小鼠减少，随着病情的进展，nephrin、podocin显著减少；而给予帕立骨化醇可以上调db/db小鼠肾组织nephrin和podocin的表达。电镜结果显示db/db小鼠肾小球基底膜较db/m小鼠增厚，可见足突融合，帕立骨化醇干预后基底膜和足突病变减轻。上述现象提示VDR及VDRA可以阻止nephrin和podocin的减少，从而减轻足细胞和肾脏损伤。与上述研究结果基34 讨论本一致。已知，糖尿病肾病的病理改变的基础主要是细胞外基质（ECM）的堆积，α-SMA、MMP9是间充质细胞标记蛋白[65-66]。DN时足细胞常常发生上皮细胞向间充质细胞转化，即上皮细胞转分化（EMT）[66]。α-SMA是由间质成纤维细胞分泌的一种蛋白[67]。研究表明肾间质成纤维细胞是参与肾脏纤维化病理过程的主要效应细胞。正常情况下，肾间质成纤维细胞处于静止状态，是一类低代谢，非激活状态的细胞。当有刺激作用时，肾间质成纤维细胞活化，分泌α-smoothmuscleaetin（α-SMA）蛋白增加以及细胞外细胞外基质分泌增加，这与肾间质纤维化速度密切相关[68]。基质金属蛋白酶-9（MMP9）又称明胶酶B，是基质金属蛋白酶(MMPs)家族中重要一员，其作用主要是降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、明胶以及弹性纤维等。有关MMP9的研究不多。部分研究显示高血糖可调节肾小球脏层上皮细胞内基质金属蛋白酶的表达和活性，且足细胞在高糖环境中主要优先调节MMP9的活性[69-70]。提示MMP9在DKD中可能起保护足细胞作用。本研究发现，db/db小鼠间充质标记蛋白α-SMA、MMP9较db/m小鼠增多，随着病情的进展，α-SMA、MMP9显著增多；而给予帕立骨化醇可以抑制db/db小鼠肾组织α-SMA、MMP9增多的表达，α-SMA研究结果与既往结果一致，MMP9研究结果与以往研究部分一致。目前对MMP9的研究有不少争议，具体机制尚不清楚。有人认为MMP9在DKD中的表达是动态变化的[71]。基于自己的研究我们认为可能是早期时MMP9一过性增加。35 结论结论VDR可通过调控Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-catenin，保护糖尿病肾病小鼠损伤的足细胞和肾脏，进而减少蛋白尿。36 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综述综述糖尿病肾病卢从群综述刘章锁校稿糖尿病（DM）是一种慢性疾病，其主要特征是高血糖，长期的糖尿病病史会增加微血管和大血管退行性并发症的可能性，并导致其发病率和死亡率的增加[1]。在过去的二十年中，虽然糖尿病患者的预防保健有所改善，糖尿病相关并发症的发生率也都有所下降，但是由于世界范围内糖尿病患病率的持续增加，相关疾病的负担仍然存在。糖尿病并发症的出现受到了个体易感性的遗传因素和独立的促进因素（如高血压，高同型半胱氨酸血症和左心功能不全）两方面的影响[2-4]。DN目前定义为：1型糖尿病患者发病10年以上伴微量蛋白尿和视网膜病变；1型或2型糖尿病患者伴不明原因的微量蛋白尿的发生。DN也表现为肾小球滤过率下降伴早期蛋白尿，尤其是在服用肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂（renin–angiotensin–aldosteronesysteminhibitorRAASi）的患者中。DN的病理特征有三个主要部分：弥漫性系膜基质增生，肾小球基底膜弥漫性增厚，以及动脉玻璃样变。然而，在功能上，其病生特征表现为系膜、肾小球毛细血管壁、小管间质和肾内血管的功能障碍。对所有的DN患者来说，全面治疗包括联合RAAS抑制剂控制血糖和高血压，脂质控制，限制钠盐饮食，减少蛋白摄入量，增加运动量，减体重，戒烟。这些管理措施可以减缓肾脏疾病进展的速率和降低心血管事件的风险。因此，本文对有关DN的发病机制、诊断和治疗的最近数据，并做了以下综述。1发病机制糖尿病肾病是终末期肾脏病的主要病因，也是炎症、代谢及血流动力学三者相互作用的结果。通常上述的三种因素会引起肾小球、肾小管上皮细胞、间质成纤维细胞和血管内皮细胞的结构异常。在过去的几十年里，对糖尿病肾病发42 综述病机制的研究方面有了重要的进展。目前已发现：血糖控制不良、长时间糖尿病、胰岛素抵抗、高血压（BP）、年龄增长、吸烟、种族、和遗传倾向是DN的发展的主要危险因素。许多基因被认为是DN的风险因素[5]。DN是一个经典复杂的疾病，在既定的个体中DN的发展很可能是环境因素调控的多个基因表达的结果。编码血管紧张素转换酶、血管紧张素II（ANGII）受体、葡萄糖代谢途径、脂质代谢（载脂蛋白E基因多态性）、细胞外基质和炎症因子等基因被认为与DN发病机制相关[6,7]。1.1高血糖高血糖引起的代谢和血液动力学刺激物质是肾损伤的介质[8,9]。这些激活的炎症，促氧化剂，缺血和纤维化通路导致系膜基质积聚；足细胞缺失；肾小球基底膜（glomerularbasementmembraneGBM）增厚;内皮功能障碍;肾小管萎缩，纤维化；肾小管间质炎症和肾小动脉玻璃样变[8]。1.2血流动力学因素促进DN的血流动力学因素包括增加的全身和肾小球内压力和各种血管活性激素的活化，包括肾内-肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS），一氧化氮，血管内皮生长因子（VEGF）和内皮素。血流动力学变化发挥重要的作用，在疾病的早期已经存在，加剧白蛋白滤过肾小球毛细血管，并刺激系膜基质扩张，足细胞损伤和肾损失[10].1.3代谢因素高血糖通过增加细胞内葡萄糖的利用加速肾脏疾病的发展。促进葡萄糖转运体GLUT1介导肾小球膜细胞葡萄糖通量，导致一系列介导肾小球硬化的信号级联反应活化，包括转分化生长因子β（TGF-β），糖基化终级产物（AGEs），蛋白激酶C，以及各种细胞因子和生长因子[11]。此外，由于长期血糖的刺激，磷酸化p38（PP38）-促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性降低也可能导致足细胞骨架改变和蛋白尿[12]。在慢性高血糖中，葡萄糖结合在循环或组织蛋白的自由氨基上。这种非酶促43 综述过程初步形成可逆的早期糖基化产物与以后不可逆转的糖基化终级产物。终产物激活特定的受体，诱导细胞功能紊乱和伤害。终产物加速肾小球细胞外基质蛋白的积累，抑制相关胶原酶的活性。与糖基化终级产物相关的足细胞裂隙膜的功能障碍可能导致蛋白尿的发生[13]。1.4氧化应激/炎症传统上在糖尿病中高糖诱导产生的过多的氧自由基与糖尿病并发症发病机制有关[14]。最近有研究提出升高的超氧化产物导致DN的假设。Dugan等[15]在实验模型中发现，DN中线粒体超氧化物很少，线粒体超氧化物增多可能减弱DN。因此，除了血糖和血压的控制，恢复线粒体的结构、功能和信号可能是改善DN和防止器官功能下降的新方法。代谢途径是DN的主要调节途径。它们激活免疫系统和慢性炎症。一些研究表明，肾小球中单核细胞/巨噬细胞少量的增加在DN的发展中有显著促使作用。肾脏固有细胞，包括系膜，肾小球内皮，树突和肾小管细胞，能够产生炎性细胞因子和生长因子，主要是VEGF，TGF-β，白介素-1（IL-1），IL-6和IL-18，以及肿瘤坏死因子（TNF-α），都参与DN进展[16]。基质蛋白积累是DN中进行性肾损伤的主要决定因素。它可能会导致合成的增加和/或基质蛋白的降解减少[17]。最近发现非编码RNA，如微小miRs通常作为mRNA转录的抑制因子。越来越多的miRs参与DN的发展，包括192，21，29C，93，141，216α，377和200等[18,19]。这些都被认为与DN炎症和纤维化有关[20,21]。miRs在阐明DN的发病机理和作为治疗目标的潜力的价值正在研究中。2临床分期糖尿病肾病患者临床特征表现为尿蛋白排泄率增高和肾功能减退，有危险因素的患者经历正常蛋白尿、微量蛋白尿、大量蛋白尿，最终进入到ERSD。然而，随着治疗不仅病情进展减慢，而且这些时期有可塑性，可从很严重时期回归到比较严重时期。易感者可从正常蛋白尿进展为微量蛋白尿，大量蛋白尿和最终进入到ERSD。持续尿蛋白排泄量在30mg/d到300mg/d之间定义为微量蛋白尿。糖尿病很大一部分患者可自发性出现微量蛋白尿转为正常蛋白尿[22]。然而，持44 综述续微量蛋白尿的患者有发展为显性肾病和心血管疾病的高风险。蛋白尿超过300mg/d称为显性肾病。一旦大量蛋白尿出现，在1型和2型糖尿病患者都出现CFR降低。高血压加剧GFR的损失。先前调查研究DN的自然病史提示在GFR波动于2mL/min/y-20mL/min/y时呈高速变化的线性关系。这种下降的速率明显少于高血压和血糖的控制。一项近期研究发现GFR下降的速度在0mL/min/y-4mL/min/y之间[23]。因此，治疗良好的患者能长时间维持肾功能的稳定。3诊断标准以下建议是基于2012年最新的肾病生存质量倡议（KDOQI）发表的糖尿病肾病临床实践指南提出的[24]。筛查蛋白尿应在1型糖尿病有5年糖尿病病程的患者和诊断为2型糖尿病的患者中进行。首选的检查指标是晨尿白蛋白/肌酐比值。如果微量白蛋白尿存在，应在6个月内重复测量3次，有2次阳性结果则认为有持续性蛋白尿。DN是很可能发生在以下糖尿病患者中：有微量白蛋白尿持续或明显蛋白尿，至少有10年病史和/或糖尿病性视网膜病，和无临床和病史原因的异常蛋白尿。如果非典型特征存在，包括肾病的发生早于预测、肾病沉积物的存在、肾功能急剧性下降、或筛选过程中所获得的血清学异常的存在，此时需要肾脏活检来明确临床诊断。通过常规眼科检查评估视网膜病变可以用来预测肾病。视网膜病变与有明显肾病和肾小球滤过率30-60mL/min/1.73m2紧密相关。然而，这种关联在早期不明显，和1型糖尿病比较少用来预测2型糖尿病[25]。4治疗干预DN的预防和治疗一般措施，包括用RAAS抑制剂严格控制血压（RAASi），控制血糖，治疗血脂异常，以及改变饮食和生活方式，包括运动、适当减肥和戒烟等。45 综述4.1血糖控制[26，27]控制血糖可以预防及改善微血管并发症。作为保护肾脏的措施，血糖控制的有效性部分依赖于糖代谢正常的水平和开始治疗的时期。控制血糖可以部分逆转早期肾小球超滤和新发微量蛋白尿[27-29]。血糖控制还可以稳定或延缓糖尿病患者的显性肾病的进展[30]。然而，一些研究发现进行性DN患者即使给予强化血糖控制，也可能效果不明显。糖尿病控制和并发症试验（DCCT）比较了常规治疗和强化血糖控制在1型糖尿病的长期并发症的发生和发展的作用。在9年的时间里，接受强化治疗的患者[平均糖化血红蛋白（HbA1c）7％]与对照组（平均HbA1c水平9％）相比，降低了发生微量白蛋白尿35-45％的风险[29]。最近，糖尿病干预和并发症的流行病学（EDIC）试验的数据表明，接受平均12年的强化血糖控制的方案治疗的患者比常规治疗的患者其受损的肾小球滤过率的长期风险降低50%。直到随机分组治疗10年以上，除了DCCT治疗干预的时期，这种效应才明显[31]。这表明，高血糖的早期和长期控制可显著改善DN，即使血糖控制不严格该有益效果仍然存在。此外，1型糖尿病患者胰腺移植后控制血糖的好处也有报道，在此类患者中肾组织系膜基质增生、肾小球和肾小管基底膜增厚、结节性肾小球病变显著[32，33]缓解或恢复正常。然而，组织重塑是一个缓慢的过程，移植服药后约10年。熊本研究报告指出当年轻的2型糖尿病患者维持HbA1c为7.0%时微量白蛋白尿可以减少60％[34]。在英国前瞻性糖尿病研究（UKPDS）试验中，初诊为2型糖尿病患者被随机安排给予磺脲类或胰岛素的强化治疗(HbA1c7.0%)，或者单用饮食的常规管理(HbA1c7.9%)。经过9年的治疗，严格控制血糖降低了微白蛋白尿24％的发生率[27]。此外，该UKPDS研究终止后，随机分配到较低的HbA1c治疗目标的2型糖尿病患者，任何原因导致的心肌梗塞和死亡的危险继续减少并持续到随机分组后的10年，不管研究结束后在某些情况下出现的较高的糖化血红蛋白[35]。给予强化治疗后的一段时期糖尿病并发症的持续保护作用仍在存在，即使随后给予常规治疗，这一现象被描述为一个“遗留效应”。这一观察提示在并发症出现之前早期控制血糖的重要性。最近的研究（一系列运动研究试验试图获得较低的HbA1c（<6-6.5％）的目标）表明在较大年龄和病程长的糖尿病患者中极其严格的血糖控制不能防止大血管并发症[36-38]。虽然在ACCORD试验中发现蛋白尿是可控的，严格控制血糖与任何原因引起的死亡率上升22%有关[36]。因此，严格血糖控制对预防大血管并发症的作用不太确定，特别是在长病程的患者。最近的一项系统评价表明，强化血糖控制减少了微白蛋白尿和蛋白46 综述尿的危险，但是缺乏证据表明强化血糖控制可以减少血肌酐，终末期肾病，或死亡的危险[39]。晚期慢性肾脏疾病（CKD）和透析患者胰岛素需求量减少，易频发低血糖。受损的胰岛素敏感性和有缺陷的糖异生，连同营养不良，慢性炎症，儿茶酚胺释放不足和肾脏胰岛素降解和清除受损，可导致CKD和终末期肾病患者低血糖[40-42]。因此，积极的控制血糖，不能常规推荐用于所有降低死亡风险的DN患者。降糖治疗必须在糖尿病肾病患者个体化。KDOQI和肾病改善全球成果（KDIGO）推荐无论是否有CKD，糖化血红蛋白控制目标分别是<7％或~7％，这个目标与普遍的糖尿病管理相一致[43]。然而，这些建议都没有证据支持，因为很少有研究关于在CKD或ESRD晚期强化血糖[44，45]控制的好处和风险。严格控制血糖对患者的益处包括短糖尿病病程，延长寿命，没有显著心血管疾病。不太严格的HbA1c目标（如<8％）可能对低血糖的风险较高和血糖难以控制的患者适用，这些患者存在未发现的低血糖，生存期望有限，广泛合并症，和/或严重的微血管和大血管并发症，包括晚期CKD[45]。许多降糖剂经肾脏排泄，因此在CKD需要调整剂量。4.2.血压控制在1型和2型糖尿病患者，早期治疗高血压对DN的预防和治疗非常重要。许多已发表的指南推荐：糖尿病患者的目标血压应<130/80mmHg[43]。然而，ACCORD提出不同的意见。其中高危心血管因素的随机分为两组，一组收缩压目标值<120mmHg，而另一组标准疗法收缩压目标<140mmHg，结果发现主要心血管事件的风险无差别;但当收缩压<120mmHg时高钾血症和肾功能不全的发生率增高[46]。在厄贝沙坦糖尿病肾病试验（IDNT）的二次分析中发现，逐步降低收缩压至120mmHg与改善肾功能和生存率相关[47]。因此，鉴于缺少收缩压<130mmHg时效益的有力证据，有些研究把血压维持在<140/90mmHg作糖尿病患者血压控制目标。在DN、CKD、年轻患者、以及有中风危险的患者中，血压应该控制在130/80mmHg以下。KDIGO对CKD的血压管理临床实践指引推荐：蛋白尿>30mg/d的糖尿病患者血压控制在130/80mmHg以下，蛋白尿<30mg/d的糖尿病患者血压控制在140/90mmHg以下[48]。此外，KDIGO指出要根据患者的年龄、心血管疾病和其他并发症、进展为CKD的风险、糖尿病性视网膜病变47 综述存在与否以及治疗的耐受性进行个体化治疗。4.3肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制药物（RAASI）肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）在调控血压及体内钠平衡方面起着关键性的作用。血管紧张素II它作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的一个主要效应物，可以通过作用于血管紧张素1型受体和血管紧张素2型（AT1，AT2）受体来增加肾小球入球小动脉和出球小动脉的血管紧张性，进而调节肾小球内压。血管紧张素1型（AT1）受体被激活后，除了会引起血流动力学效应以外，还能够触发一系列介导糖尿病肾病进展的促炎因子和促纤维化因子的表达和释放[49]。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素受体拮抗剂（ARB类药物）属于治疗高血压糖尿病的一线药物，不仅能够有效的控制血压，还可以减缓糖尿病肾病的进展[50]。有研究表明，对于伴有持续性微量白蛋白尿及出现明显肾脏病变的1型糖尿病患者，使用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）治疗能够减少蛋白尿、延缓[51，52]肾脏病的进展，这一观点早在20多年前的一篇研究中就提到过，在这一项具有里程碑意义的随机研究中发现，对尿蛋白＞500mg/d、血肌酐≤2.5mg/dL的1型糖尿病的患者，随机使用卡托普利和安慰剂进行治疗。与对照安慰剂处理组相比，卡托普利能够减轻患者肾功能的恶化，降低疾病的死亡风险、透析风险及血肌酐倍增的风险[53]。随后的一篇Meta分析也再次证实了这一发现[54]。但是现在仍缺乏大量长期的临床试验来确认ARB类药物在1型糖尿病肾病（DN）中的疗效。尽管如此，根据已知的血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素受体拮抗剂（ARB类药物）的药理特点，我们更有理由推测这两种药物可以用来有效地治疗1型糖尿病。对于血压正常且白蛋白尿处于正常范围的1型糖尿病患者，大部分的（不是所有的）临床试验表明RAASI并不能阻止肾脏疾病的进展[55-57]。同时，KDOQI2012糖尿病指南建议，对于血压正常且白蛋白尿处于正常范围的1糖尿病患者的一级预防中尽量不要使用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素受体拮抗剂（ARB类药物）。对于伴有高血压而白蛋白尿处于正常范围的2型糖尿病患者，在血压控制良好的前提下，经奥美沙坦治疗的患者与未经奥美沙坦治疗的患者相比，前者微量白蛋白尿的发生率有所下降。据统计，奥美沙坦可将微量白蛋白尿的发生率从9.8%降低至8.2%。值48 综述得关注的是，有冠心病病史（尤其伴有低血压）的患者在使用ARB后，其心血管致命率可能会有所提升[58]。在贝加莫糖尿病肾脏并发症实验（BergamoNephrologicDiabetesComplicationsTrialBENEDICT）中，将伴有高血压而白蛋白尿处于正常范围的2型糖尿病患者随机分为四组，分别给予安慰剂、维拉帕米、群多普利、维拉帕米联合群多普利进行治疗，然后检测四组患者的白蛋白尿水平，结果显示，后两组患者中进展为微量白蛋白尿的概率较低[55]。总的来说，从预防的角度而言，使用RAASI来预防微量白蛋白尿的弊大于利。“厄贝沙坦在2型糖尿病微量白蛋白尿中的作用(IRMA2)研究”对伴有高血压的2型糖尿病患者开展了为期两年的随访，结果显示ARB能够阻止70%的患者出现明显的肾脏病变[59]。“缬沙坦减轻微量白蛋白尿（MARVAL）的研究”中发现，与具有同等程度降低血压水平的氨氯地平相比，ARB能够更大程度的降低白蛋白尿，这表明ARB的抗蛋白尿作用并不依赖于血压的改变[60]，因此RAASI被推荐用来延缓微量白蛋白尿进展为显性蛋白尿。与ARBs相比，有关ACEI对2型糖尿病疗效的统计数据相对较少。这很大程度上是因为研究证据不足或随访时间较短。然而，也一些研究指出，与其它降压药物相比，ACEI能够很大程度地降低白蛋白尿、减缓肾功能的恶化。另外，“替米沙坦和依那普利治疗糖尿病（DETAIL）的研究”是一项随机对照研究，在250例早期肾脏病患者中随机采取依那普利或替米沙坦开展治疗，对比两者的疗效[61]，5年后发现两组患者GFR、BP、血肌酐、尿白蛋白的下降程度及出现终末期肾病、心血管并发症和死亡率都较为相似。这项研究结果与临床工作中“ARBs和ACEI在治疗2型糖尿病中发挥同等程度疗效”的观点是一致的。RAASI的联合使用：从理论上讲，ACEI与ARB的联合使用能够双重阻断RAAS，故而联合治疗糖尿病肾病的疗效应该会远远优于单个药物[62]。一项正在进行的全球疾病终点试验（ONTARGET）指出，对于伴有较高心血管疾病风险的患者而言，与单药治疗相比，ACEI与ARB的联合治疗不仅能够减轻蛋白尿，而且从很大程度上阻止了微量白蛋白尿及大量白蛋白尿的进展。然而，与单药治疗方案相比，RAASI联合治疗方案可能会诱发更多疾病晚期征象的出现（如紧急透析、血肌酐的倍增乃至死亡）[63]。近日，VANEPHRON-D试验没能证实联合治疗方案对肾脏疾病的进展、死亡率及并发心血管事件是否有较好的疗效。而ONTARGET指出，联合治疗方案可能会增加疾病相关的严重不良反应事件的风险（如急性肾损伤和高钾血症）[64]。KDIGO指南认为，尚没有比较充足的研49 综述究依据证明联合使用ACEI与ARB能够阻止慢性肾脏病（CKD）的进展[44]。总之，目前糖尿病的治疗中并不推荐联合使用两种RAAS的阻断药物[65]。ACEI和ARB的剂量及副作用研究：从部分程度上而言，ACEI和ARB的抗蛋白尿作用与降压作用互不依赖。有时，针对不同的个体，控制血压的最佳药物剂量未必是降低蛋白尿的理想剂量[66]。大剂量使用ACEI或ARBs能够引起一系列副作用，如高钾血症、低血压和肾小球滤过率（GFR）的下降。同时，对于有肾损伤且出现蛋白尿的患者而言，使用ACEI治疗后会将其血肌酐水平升高至30%。此时血肌酐的升高可能与肾脏开启自我保护模式有关，因此，针对此类患者也可暂不停用ACEI，而当ACEI引起的血肌酐的上升幅度高于30％时，这可能会增加出现肾动脉狭窄的风险。ACEI或ARB使用剂量的骤升（尤其是在与利尿剂联合使用的情况下）可能引发急性肾损伤。在慢性肾脏病（CKD）病程进展过程中，ACEI和ARB虽然不属于禁忌药物，但是骤然使用该药物或者盲目骤升使用剂量可能会增加透析风险，因此，在使用该药物时需谨慎小心。一项小规模研究表明，对于个别糖尿病肾病患者，停用RAASI药物后其肾功能可能会有所恢复[67]。因此，当患者尚达不到建立永久性血管通路的标准，或者不适合使用透析治疗时，可采用上述方法可能会使其肾功能有所改善。4.4新的治疗手段现阶段仍需要对糖尿病肾病的预防措施与治疗方法进行探究和改进，基于许多实验性研究数据，各种抗氧化剂和抗炎药物已被建议用于糖尿病肾病的治疗[68]。其中关于抗氧化剂被用于糖尿病肾病的治疗的研究结果还存在争议。尽管给予1型糖尿病患者高剂量（1800IU/天）维生素E，其肾脏功能可以得到改善[69]，但是给予出现微量蛋白尿的患者维生素E（400IU/天）的治疗，并不能显著降低其患心血管疾病的风险[70]。抗炎药物趋化因子抑制剂，如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL2），阿司匹林和环氧合酶-2抑制剂（COX-2），3-羟基-3-甲基辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，内皮素受体拮抗剂，PKC抑制剂，非诺贝特，吡哆胺，二盐酸盐和己酮可可碱效用也存在争议[68]。到现在为止，支持这些药物可以用于治疗DN的数据并不充足。但是一项荟萃分析显示，己酮可可碱可以降低尿蛋白，而且其具有和ACE阻断剂相似的降低尿蛋白的作用[71]。50 综述而且，II期临床试验已显示鲁伯斯塔（蛋白激酶Cβ亚型选择性抑制剂）能显著减少蛋白尿，并能使肾小球滤过率保持稳定[72]。一项有意义的临床前数据显示，dipeptyl肽酶-4拮抗剂和胰高血糖素样-1多肽类药物除了能够降低血糖以外，还[73，74]能够减缓糖尿病肾病的进展然而，这类药物尚没有在患者中投入使用和验证[75]。仍需要大规模临床试验来证实该类药物的安全性及验证其对糖尿病肾病的疗效。5结论糖尿病肾病是引起终末期肾脏病的主要病因之一，并且与心血管疾病的发病率与死亡率密切相关。糖尿病和糖尿病肾病的病理生理学机制比较复杂，包括血流动力学的改变、代谢途径异常、氧化应激损伤以及细胞因子、生长因子的释放，这一系列改变最终引起了肾脏损伤。现阶段最主要的药物治疗方法包括：控制血压、控制血糖以及用ACEI和/或ARB类药物抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统。同时也包括一些支持治疗，如血脂的控制、饮食限制、戒烟、减肥等。从病理生理学的角度来预防和治疗糖尿病肾病的新疗法尚待进一步研究。51 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个人简历及在校期间发表的学术论文个人简历及在校期间发表的学术论文个人简历卢从群，女，出生于1989年05月，河南省信阳市人。2007年考入河南科技大学临床医学系，于2012年毕业并取得学士学位，2013年考入郑州大学攻读硕士学位。导师为刘章锁教授，专业为肾脏病学，研究方向为慢性肾脏病的防治。在校期间发表的学术论文卢从群，张方兴.帕立骨化醇抑制糖尿病肾病小鼠肾脏炎症反应.中国全科医学，2016.8.57 致谢致谢研究生阶段即将过去，在这三年的学习时间里，我收获了对我以后人生至关重要的东西--责任。在此，我首先要感谢敬爱的刘章锁老导师在学习和生活中给了我帮助和鼓励。刘老师工作严谨认真，一丝不苟，对患者关爱，对学生要求严格。俗话说“良药苦口利于病，忠言逆耳利于行”，正是您的言行身教让我不断认识自我，超越自我。衷心感谢您三年来对我的精心培养和谆谆教诲！我将永远感激您！衷心感谢肾内科郭佳老师，您不是我的导师，但却无私的给予我关心和帮助，感谢张军军老师、郭佳老师、刘东伟师兄、张茜师姐、陆明蕾师姐、刘风勋师兄给予的无私指导和热情帮助！衷心感谢我的同伴、师妹以及室友们，这三年里因为有你们的陪伴和支持，激励我一次次从挫折和失败中总结教训，不断努力走向成功！衷心感谢肾病实验室王春燕老师及肾脏病理室周雅丽老师，权松霞老师对我的指导和支持！衷心感谢参加论文评阅及答辩委员会的各位专家！最后，衷心感谢我的家人在我三年学习期间对我的关爱、支持和鼓励！58
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