ezrin蛋白在糖尿病肾病鼠肾小球的表达及活性维生素d对其的影响

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1、Ezrin蛋白在糖尿病肾病鼠肾小球的表达及活性维生素D对其的影响：杨媛媛，邹敏书余健聂国明罗莉漫徐洪涛赵林双何威逊【摘要】目的：观察Ezrin蛋白在糖尿病肾病(DN)大鼠肾小球的表达以及活性维生素D[1,25(OH)2D3]对其表达的影响。方法:)外侧的终末分化细胞，构成肾小球滤过膜上机械屏障和电荷屏障的重要组成部分，其紧贴于肾小球基底膜(GBM)外侧。因此，PC损伤、脱落是蛋白尿发生的病理基础之一。近年来，PC内部结构的特殊蛋白成为研究的热点。podocalyxin(PCX)、钠氢交换调节因子2(NHERF2)、Ezrin分布于PC足突顶部，三者构成PCX/NHERF2/Ezri

2、n复合体参与了PC生理和病理的发生机制，其中PCX是维持负电荷屏障和保持足细胞形态的重要分子，它通过NHERF2/Erzin与肌动蛋白骨架αactinin4连接，维持PC结构稳定[1]。Ezrin参与PC形态的维持、运动、黏附，并与PC生存有关。活性维生素D[1,25(OH)2D3]是临床上常用的药物，其可减少PC脱落，多途径保护肾脏[2]。而其对Ezrin蛋白表达的影响作用不明。本文在DN模型鼠上观察1,25(OH)2D3对Ezrin表达及PC排泄的影响，探讨对其肾保护作用的机制。　　1材料与方法　　1.1糖尿病肾病大鼠的建立及分组　　健康雄性大鼠模型制备成功，继续喂养，3

3、周后用双缩脲法测定尿蛋白定量≥30mg/24h时，确认DN模型制备成功，将20只诱导成功的DN大鼠随机分两组：(1)DN组(n=10);(2)1,25(OH)2D3组(n=10)，埋植渗透性微量泵按0.03ng/g·d-1皮下给予1,25(OH)2D3[3]，连用8周。对照组(n=10)及DN组皮下给予等体积的蒸馏水。给予1,25(OH)2D38周抽血查餐后2h血糖(Glu)、血清肌酐(Scr)，代谢笼收集24h尿液，检测24h尿蛋白(24hUP)及尿液足细胞(UPC);然后处死大鼠，取出双肾，计算双肾与体重之比，后肾小球免疫组化及免疫荧光染色。　　1.224hUP、UPC检测

4、　　24hUP用考马斯亮蓝比色法测定。UPC检测按邹敏书等报道[4]的方法进行，以间接免疫荧光方法检测肾小球足细胞特异性核心蛋白arkers公司，FITC标记山羊抗小鼠二抗购自中山公司。　　1.3免疫组化检测肾小球足细胞数量　　3μm厚的肾组织切片常规处理，PAS染色，在普通光学显微镜下观察肾组织的病理变化。肾组织石蜡切片，微波抗原修复，小鼠抗Ezrin单克隆抗体(1∶50稀释，福建迈新生物技术开发公司)，4℃孵育过夜，PBS洗涤，FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体，室温孵育40min，PBS洗涤，封片，以PBS代替一抗为阴性对照。结果采用荧光显微镜(上海宙山精密光学仪器有限化司)观察

5、。利用LaserPix4.0分析软件，在每一例切片上随机分别测量10个肾小球面积和每个肾小球内Ezrin阳性区域所占的面积，计算出每个肾小球内Ezrin阳性区域所占肾小球面积的比值，取其平均值。　　1.5统计学处理　　所有数据用(±s)表示，用SPSS11.0统计软件完成，先进行方差齐性检验，方差齐时，多组比较用onean等级相关分析法，P<0.05具有统计学意义。　　3组大鼠肾球Ezrin的荧光分布及蛋白(Ezrin，Radixin，Moesin)家族的一员，为细胞内蛋白，通过氨基端与细胞膜相连，羧基端与肌动蛋白细胞骨架相连，成为膜细胞骨架的连接子。Exrin作为PC的标

6、志蛋白之一，其一端与PC顶膜区表面覆盖一层负电荷的涎粘蛋白PCX及NHERF2相连，另一端与肌动蛋白相连，对维持负电荷和保持PC形态起重要作用。OstalskaNoRNA表达与蛋白尿与肌酐清除率相关;单用抗TNFα或TGFβ抗体可部分恢复Exrin的表达，2种抗体联用可完全恢复Exrin的表达。本文结果表明，Ezrin表达与肾小球PC数目呈正相关，与尿蛋白及尿PC排泄呈负相关。表明Ezrin正常表达对防止PC脱落，维持肾小球PC数目，减轻蛋白尿起重要作用。PC损伤脱落，肾小球PC数量减少，不仅可引起蛋白尿，且有报道，尿液中脱落PC数量较尿蛋白更加敏感地反映进展性肾小球损伤[8

7、]。　　1,25(OH)2D3是临床中常用的药物，对肾脏的保护作用初现端倪:减少PC丢失及肥大;通过抑制肾素生成，下调肾素血管紧张素系统(RAS)系统;降低慢性肾疾病(CHD)蛋白尿;降低纤维细胞因子TGFβ的生成[9]。但对PC保护作用机制尚不明确。Kuhlmann[3]报道1,25(OH)2D3可减少肾大部分切除鼠PC肥大及丢失，进而减轻蛋白尿及肾小球硬化。SchSocNephrol,2002,13(12):30053015.　　2邹敏书,余